Un PHS Grant (MH51393) ont soutenu ce travail. Une partie de l&#39;aplysie, nous utilisons sont fournis par le national de ressources pour l&#39;aplysie de l&#39;Université de Miami dans le cadre de la Subvention RR10294 Centre national de recherche sur les ressources, le NIH.

1. Préparation <ol><li> Anesthésier l&#39;animal en injectant 75-100 ml solution isotonique de chlorure de magnésium. L&#39;aplysie nous utilisons pour l&#39;imagerie sont généralement 150-200 grammes et sont obtenus à partir Marinus scientifique. </li><li> Pin l&#39;animal anesthésié dans un plat recouvert de cire. Aiguilles de seringues fonctionnent bien à cette fin, les techniques stériles ne sont pas nécessaires. En utilisant des pinces et ciseaux bruts standards faire une incision dans le pied de l&#39;animal et d&#39;exposer la masse buccale. Localisez le ganglion vestibulaire. Avec des ciseaux à ressort et pinces fines, soigneusement gratuitement le ganglion en coupant tous les nerfs buccaux. </li><li> Retirer le ganglion et le placer dans un plat Sylgard enrobé contenant eau de mer artificielle. Placez un peu de broches d&#39;insectes à travers les nerfs buccaux pour stabiliser le ganglion. Desheath le ganglion buccal aide d&#39;une pince à ressort ultrafines et des ciseaux, de manière à exposer les neurones pour l&#39;enregistrement intracellulaire. Puis re-épingler le ganglion en utilisant environ 15 insectes fine (minutien) broches. Le ganglion doit être maintenu fermement en place comme tout mouvement sera problématique lors de l&#39;imagerie. </li></ol> 2. Préparer électrodes <ol><li> Tirer électrodes en utilisant un tube de verre capillaire (par exemple avec des filaments de WPI TW100F-4) et un extracteur. Les paramètres doivent être déterminés individuellement pour créer des électrodes de la résistance requise. Lorsqu&#39;il est rempli avec 3 M KAc (acétate de potassium), notre résistance de l&#39;électrode est généralement d&#39;environ 10 MOhms si les électrodes sont à chanfreiner, ou environ 5 MOhms si l&#39;étape de biseautage est omise. </li><li> Remplir une série d&#39;électrodes avec une solution contenant 3 mM de KCl M KAc/30 aide d&#39;une seringue et d&#39;une aiguille Microfil. Ces électrodes seront utilisés pour l&#39;électrophysiologie. </li><li> Remplir un second ensemble d&#39;électrodes avec le colorant indicateur de calcium par trempage de l&#39;extrémité arrière de l&#39;électrode de colorant, préalablement reconstitué avec env. 40 pl d&#39;eau distillée pour la teinture 500 pg. Lorsque la pointe de l&#39;électrode est rempli, le remblai environ 1/4 poucede l&#39;extrémité de l&#39;électrode avec 200 mM KCl pour assurer un bon contact électrique. </li><li> Il est bénéfique pour biseauter les électrodes, ce qui facilite l&#39;injection de colorant et de réduire les dommages causés par des pénétrations multiples membrane. Nous utilisons un beveler personnalisé qui génère un flux d&#39;une suspension de poudre de sel de l&#39;eau / alumine. L&#39;électrode est montée dans un support et sa pointe pénètre dans la circulation à un angle de 45 °. Résistance de l&#39;électrode est surveillée en permanence et le biseautage terminé lorsque la résistance atteint environ 5 MOhm pour électrodes KAC remplis. Les électrodes remplies de colorant sont biseautés pour une quantité égale de temps et ont généralement des résistances de MOhm 15-20. </li></ol> 3. Chargement du colorant indicateur de calcium <ol><li> Placez la préparation sur une plate-forme d&#39;électrophysiologie et de localiser visuellement le neurone présynaptique d&#39;intérêt. Beaucoup de nos expériences sont effectuées avec un neurone sensoriel identifié utilisée lors de l&#39;alimentation, B21 5, 6. La positio relativement fixen, la taille (~ 100 um), et la forme allongée de soma B21 le rendent plus facile à localiser. </li><li> Empaler le neurone d&#39;intérêt avec une électrode contenant le colorant indicateur de calcium. B21 identité peut être vérifiée par l&#39;empalement post-synaptique neurone B8. Dépolarisation de B21 avec ~ 8 nA de courant va déclencher les pointes et les résultats pour faciliter les PSP en B8 7. </li><li> Injecter un colorant dans le neurone présynaptique d&#39;intérêt en passant impulsions hyperpolarisants (typiquement -15 nA, 1 Hz, rapport cyclique 75%) pendant environ 30 minutes. Si le chargement colorant est réussie, le soma du neurone va acquérir une couleur rose pâle. Retirer l&#39;électrode contenant un colorant lentement en le retirant du neurone. </li><li> Laisser la préparation pendant environ 30 minutes pour permettre au colorant de se diffuser dans les processus fines qui entrent en contact synaptique avec les neurones suiveurs. </li></ol> 4. Imagerie de calcium et d&#39;enregistrement électrophysiologique <ol><li> Placez la préparation sur la Microsc imagerieope. Le plat de la préparation se déroule sur une plate-forme de refroidissement avec des morceaux de cordon d&#39;étanchéité Permagum qui, contrairement à l&#39;argile, reste collant lorsqu&#39;il est mouillé. Le microscope à platine fixe se concentre en déplaçant l&#39;objectif. La scène reste stationnaire, ce qui permet de fixer des manipulateurs montés aimant. Comme le fort grossissement rend vibrations (mouvement latéral en particulier) d&#39;un problème, l&#39;installation d&#39;imagerie entière doit être placée sur une plate-forme d&#39;isolation des vibrations. </li><li> Empaler neurones présynaptiques et postsynaptiques avec des électrodes contenant une solution électrolytique normal. </li><li> Sélectionnez un bloc filtre approprié pour Calcium image Orange (excitation 549 nm, émission 576 nm) 8 et réglez la caméra. La plupart des scientifiques caméras CCD permet à l&#39;enquêteur de choisir un sous-ensemble de cellules CCD qui sont lues. En outre, les cellules peuvent être combinés (mis en cellule). Sélection d&#39;un petit sous-ensemble augmente la vitesse, tout en binning augmente la sensibilité. Ces deux paramètres, ainsi que le temps d&#39;exposition, déterminerle taux de trame à-dire le nombre d&#39;images peuvent être acquises par seconde. Paramètres appropriés sera l&#39;image d&#39;une zone de 580 x 350 um 2 avec 500 x 300 pixels (en utilisant un objectif 10x et un adaptateur pour appareil photo 0.5x). Ajouter des filtres de densité neutre pour la trajectoire de la lumière pour ajuster l&#39;intensité d&#39;éclairage de la quantité minimale qui fournit une exposition correcte avec un temps d&#39;exposition &lt;25 ms. Ces paramètres devraient aboutir à une cadence d&#39;environ 30 Hz - qui chez l&#39;aplysie est assez rapide pour l&#39;image unique pic évoqué des modifications de calcium. Enfin, à proximité de l&#39;ouverture de champ de sorte que seule la zone d&#39;image est éclairée. </li><li> Dans le logiciel d&#39;imagerie marquer régions du neurone que vous voulez mesurer. Dans le logiciel Elements AR cela est fait dans la &quot;Mesure de l&#39;heure» en plaçant des régions d&#39;intérêt (ROI). B21 est un neurone bipolaire et travaux antérieurs ont démontré que ses contacts processus latérales du neurone post-synaptique d&#39;intérêts 9. En général, nous l&#39;image primaire, soutien-gorge secondaire et tertiairenches latérale du processus de mise en place d&#39;une ROI sur chaque partie du neurone. Un retour sur investissement supplémentaire en regard du neurone colorant rempli est mesurée pour fournir une valeur de fond qui est ensuite soustrait de l&#39;ensemble des autres points de données. </li><li> Demandez à l&#39;acquisition d&#39;électrophysiologie (dans ces expériences II Spike) pour attendre un signal de déclenchement fourni par la fonction &quot;Lecture frame&quot; signal de la caméra. Lancement de l&#39;acquisition d&#39;image (Éléments AR); Pointe II va maintenant démarrer automatiquement l&#39;enregistrement lorsque l&#39;appareil photo prend sa première image. Vous pouvez également utiliser une sortie TTL de l&#39;alimentation de 1401 à aborder brièvement sur une LED montée dans le port caméra du microscope. Cela donnera un signal à la suite d&#39;imagerie et de synchroniser des données électrophysiologiques. </li><li> Stimuler le neurone présynaptique par injection d&#39;une série de brèves impulsions de courant de dépolarisation à la fréquence désirée. Il est important de surveiller chaque impulsion (par exemple avec un oscilloscope stimulus déclenché) pour déterminer si un potentiel d&#39;action est successfully générée. Tandis qu&#39;Orange calcium est très photo-stable par rapport à d&#39;autres colorants, c&#39;est une bonne idée d&#39;enregistrer un essai de contrôle sans stimulation pour vérifier combien teindre blanchiment se produit. </li><li> Dans les expériences où les concentrations de calcium intracellulaire sont manipulés, un médicament tel que l&#39;EGTA est introduit dans le neurone présynaptique et les étapes de l&#39;acquisition de stimulation et des données décrites ci-dessus sont répétées. </li></ol> 5. Analyse des données représentatives <ol><li> Exporter les données d&#39;imagerie (la liste des valeurs d&#39;intensité mesurées pour chaque ROI) en l&#39;inscrivant dans un fichier texte. Un script personnalisé Spike II peut ensuite importer le fichier texte. Ce script normalise également les valeurs de zone de la sonde individu, et soustrait la valeur de la sonde de fond. Les points de données sont alors tracées à côté des données d&#39;électrophysiologie comme un «virtuel RealWave« canal. Le &quot;canal de processus / fonction time shift&quot; Spike II est utilisé pour aligner avec précision l&#39;imagerie données points, ​​en utilisant le signal de référence en tant que diode. </li><li> Pour obtenir des valeurs que le changement pour cent, d&#39;analyser les données d&#39;imagerie par calcul de la variation relative de fluorescence dF / F o = (ff o) / F o. F o désigne le niveau de fluorescence, juste avant le stimulus et F la fluorescence au cours de la relance. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Diagramme d&#39;ensemble de l&#39;expérience. Des expériences sont menées dans une préparation ganglion de l&#39;aplysie. Modifications du calcium intracellulaire sont imagées avec un colorant fluorescent, qui est introduit par iontophorèse dans le neurone présynaptique. Neurones pré-et post-synaptiques sont ensuite empalé avec des électrodes pointues afin que la transmission synaptique peut être induite et contrôlée. <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig2.jpg" alt="Figure 2" /> <strong&gt; Figure 2. Imagerie calcique et l&#39;enregistrement intracellulaire de neurones identifiés dans le ganglion vestibulaire de l&#39;aplysie. (A) Photo de la branche latérale imagée de neurone B21. La boîte indique la région mesurée d&#39;intérêt. (B1) de stimulation intracellulaire de B21 évoque des potentiels d&#39;action (trace inférieure) et en facilitant les potentiels post-synaptiques (PSP) dans le neurone post-synaptique adepte B8 (milieu de trace) en le faisant aussi tirer des potentiels d&#39;action. Augmentations de fluorescence calcique présynaptique sont présentés dans la trace supérieure. (B2) Effet de l&#39;EGTA sur la facilitation présynaptique homosynaptique. EGTA a été injecté dans intracellulaire B21 ~ 15 minutes avant la stimulation intracellulaire. On pense que l&#39;EGTA est un chélateur de calcium à action lente, qui, à faible concentration n&#39;est pas assez rapide pour supprimer la transmission synaptique. Notez la réduction du signal calcique répandue et la diminution correspondante du PSP amplitude. (C) L&#39;amplitude PSP en corrélation avec le Calciu présynaptiquesignal m. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3907/3907fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

<ol>
	<li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li><li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators:+Calcium+green,+calcium+orange+and+calcium+crimson.">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li><li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators:+rapid+transient+response+to+flash+photolysis.">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li><li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2++in+leech+heart+interneurons.">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li><li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia.">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li><li>Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission.">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li><li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation.">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li><li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook. , (2005).</li><li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia.">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+38:+A+practical+guide:+Two-photon+calcium+imaging+of+spines+and+dendrites.">Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites.</a> Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à déclarer.

Nous démontrons techniques qui peuvent être utilisées pour surveiller simultanément la concentration de calcium intracellulaire et d&#39;évaluer l&#39;efficacité de la transmission synaptique. Ces techniques sont utiles pour déterminer comment les différentes formes de plasticité à court terme sont médiatisés. La formation d&#39;image est effectuée avec un microscope à fluorescence et une caméra CCD. Ces besoins en équipement sont relativement modestes par rapport à la plupa...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commenter </td></tr><tr><td> Calcium orange </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Kit tampon de calcium étalonnage </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> utile pour tester la sensibilité et la gamme dynamique du signal d&#39; </td></tr><tr><td> Chlorure de magnésium hexahydraté </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> utilisé en 0.33 M de solution pour anesthésier des animaux </td></tr></tbody></table> Réactifs Tableau 1. Utilisé. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td><td> Commenter </td></tr><tr><td> FN-1 microscope droit à fluorescence </td><td> Nikon Instruments </td><td> avec Narishige ITS-FN1 étape </td></tr><tr><td> NMN-21 manipulateurs </td><td> Narishige </td><td> monté sur scène avec des aimants </td></tr><tr><td> CooISNAP HQ 2 caméra CCD </td><td> Photométrie </td><td></td></tr><tr><td> Éléments NIS AR (Version 3.22) </td><td> Nikon Instruments </td><td> logiciel d&#39;imagerie utilisé pour acquérir les données de fluorescence </td></tr><tr><td> 10X/0.3w Plan Fluor objectif </td><td> Nikon Instruments </td><td> cette lentille à immersion de l&#39;eau a une très longue distance de travail de 3,5 mm </td></tr><tr><td> X-Cite 120 lampe aux halogénures métalliques PC </td><td> EXFO </td><td> utilisé pour l&#39;imagerie de fluorescence </td></tr><tr><td> LS-DWL Lampe halogène </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-CY3 ensemble filtre </td><td> Technologie Chroma </td><td>; </td></tr><tr><td> 1401 puissance convertisseur A / N </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> échantillonnage a été effectué à 3 kHz </td></tr><tr><td> Pic II (Version 7.07) </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> logiciel utilisé pour acquérir des données d&#39;électrophysiologie </td></tr><tr><td> SEC-10 LX amplificateur </td><td> NPI électronique </td><td> utilisé avec un headstage 10X </td></tr><tr><td> Modèle 410 amplificateur </td><td> Brownlee précision </td><td> utilisé pour amplifier et filtrer le signal d&#39; </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> moins k Technology </td><td> isolation des vibrations pour l&#39;imagerie </td></tr><tr><td> plate-forme de refroidissement </td><td> sur mesure </td><td> plaque en laiton à travers lequel de l&#39;eau glacée est pompée à un débit variable </td></tr></tbody></table> Tableau 2. L&#39;équipement utilisé.

monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia

Il a été suggéré que les changements dans le calcium intracellulaire médiation de l&#39;induction d&#39;un certain nombre d&#39;importantes formes de plasticité synaptique (par exemple, la facilitation homosynaptique) 1. Ces hypothèses peuvent être testées en même temps surveiller les changements dans le calcium intracellulaire et des changements dans l&#39;efficacité synaptique. Nous démontrons comment cela peut être réalisé en combinant l&#39;imagerie calcique avec les techniques d&#39;enregistrement intracellulaire. Nos expériences sont menées dans un ganglion vestibulaire du mollusque Aplysia californica. Cette préparation a un certain nombre de caractéristiques avantageuses expérimentalement: Ganglia peut être facilement retiré de l&#39;aplysie et expériences utilisent neurones adultes qui font de connexions synaptiques normales et ont une distribution normale d&#39;ions canal. En raison de la faible taux métabolique de l&#39;animal et les températures relativement basses (14-16 ° C) qui sont naturels pour l&#39;aplysie, les préparations sont stables pendant de longues périodes de temps. Calcium ent &quot;&gt; Pour détecter les changements dans le calcium intracellulaire libre, nous allons utiliser la version portable imperméant de calcium Orange 2 qui est facilement« chargé »dans un neurone par ionophorèse. Lorsque cette teinture fluorescente grande longueur d&#39;onde se lie au calcium, augmentation de l&#39;intensité de fluorescence. Orange a propriétés cinétiques rapides 3 et, contrairement aux colorants ratiométriques (par exemple, le Fura 2), ne nécessite pas de roue de filtres pour l&#39;imagerie. Il est assez photo stable et moins phototoxique que d&#39;autres colorants (par exemple, fluo-3) 2,4. Comme tous les non-ratiométrique colorants, de calcium Orange indique les changements relatifs à la concentration de calcium. Mais, car il n&#39;est pas possible de tenir compte des changements dans la concentration de colorant dues au chargement et à la diffusion, elle ne peut pas être calibré pour fournir les concentrations de calcium absolus. Une verticale, microscope fixe composé stade, a été utilisé pour les neurones d&#39;image avec une caméra CCD permet d&#39;enregistrer environ 30 images par seconde. Chez l&#39;aplysie cette résolution temporelleest plus que suffisant pour détecter même un seul pic induit par la modification de la concentration de calcium intracellulaire. Électrodes pointues sont utilisées simultanément pour induire et d&#39;enregistrer la transmission synaptique dans les neurones identifiés pré-et post-synaptiques. À la fin de chaque essai, un script personnalisé combine électrophysiologie et des données d&#39;imagerie. D&#39;assurer une bonne synchronisation on utilise une impulsion de lumière provenant d&#39;une diode montée dans l&#39;orifice de caméra du microscope. La manipulation des niveaux calciques présynaptiques (par exemple via l&#39;EGTA injection intracellulaire) nous permet de tester des hypothèses spécifiques, concernant le rôle du calcium intracellulaire dans la médiation de diverses formes de plasticité.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia at JoVE.com

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Nous montrons comment les changements dans la concentration de calcium libre intracellulaire et l&#39;efficacité synaptique peut être surveillés simultanément dans une préparation de ganglion<em&gt; Aplysie</em&gt;. Nous l&#39;image de calcium intracellulaire à l&#39;aide d&#39;un colorant fluorescent, orange calcium, et d&#39;induire et de contrôler la transmission synaptique avec tranchants (intracellulaire) électrodes.

Mesure des variations de la concentration de calcium intracellulaire et de l&#39;efficacité synaptique dans le mollusque<em&gt; Aplysie</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

monitoring-changes-intracellular-calcium-concentration-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

10.9K vues.  Mt. Sinai School of Medicine. Nous montrons comment les changements dans la concentration de calcium libre intracellulaire et l'efficacité synaptique peut être surveillés simultanément dans une préparation de ganglion Aplysie. Nous l'image de calcium intracellulaire à l'aide d'un colorant fluorescent, orange calcium, et d'induire et de contrôler la transmission synaptique avec tranchants (intracellulaire) électrodes.

Vidéo: Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisation des propriocepteurs dans<em&gt; Drosophila</emLes larves&gt; et pupes

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Recherche

Neurosciences

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Électroporation de la Rhombencéphale tracer des trajectoires axonales et cibles synaptiques dans l&#39;embryon de poulet

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

La jonction neuromusculaire: Synapse mesurer la taille, fragmentation et les changements dans Synaptic Protein densité en utilisant microscopie de fluorescence confocale

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Enregistrement Neuronal activité induite de Température-travers le contrôle des modifications de calcium dans le bulbe olfactif de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using calcium-sensitive fluorescent dyes that change their emission intensity or wavelength depending on the concentration of free calcium in the cell. There are several methods used to stain cells with calcium dyes. Most common are the processes of loading the dyes through a micropipette or pre-incubating with the acetoxymethyl ester forms of the dyes. However, these methods are not quite applicable to neuromuscular junctions (NMJs) due to methodological issues that arise. In this article, we present a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump of the frog nerve into the nerve endings. Since entry of external calcium into nerve terminals and the subsequent binding to the calcium dye occur within the millisecond time-scale, it is necessary to use a fast imaging system to record these interactions. Here, we describe a protocol for recording the calcium transient with a fast CCD camera.

Here, we describe a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump into the nerve endings. We also present a protocol for the recording and analysis of fast calcium transients in the peripheral nerve endings.

Chargement d&#39;un colorant de calcium dans les terminaisons nerveuses de la grenouille à travers le souche nerveuse: Inscription transitoire de calcium dans la jonction neuromusculaire de la grenouille

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Culture In Vivo-comme les Astrocytes Murine en utilisant le protocole AWESAM rapide, Simple et peu coûteux

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster In Vivo