Classe 1 deacetylases histone comme RpdA sont discutés comme de nouvelles cibles potentielles pour le traitement des infections fongiques. Cependant, des activités enzymatiques purifiées sont nécessaires pour la caractérisation supplémentaire. Le principal avantage de ce protocole est la séparation rapide et suffisante des complexes natifs marqués tap pour la détermination de l’activité en une seule étape.
Les complexes HDAC dérivés de ce protocole peuvent être utilisés pour le dépistage de l’efficacité de nouveaux inhibiteurs de la deactylase fongique spécifique. Cette méthode fournit la base pour l’extraction et la purification des protéines fongiques taguées TAP, qui pourraient être utilisées comme point de départ pour l’établissement de protocoles pour d’autres enzymes et souches. Pour commencer cette procédure, ajouter 10 millilitres de CSS à chaque flacon de conidie préparée.
Fermez fermement chaque flacon avec le bouchon à vis fourni et secouez vigoureusement. Après cela, utilisez une boucle stérile d’inoculation pour gratter complètement les conidies restantes. Passez la conidie à travers des passoires cellulaires de 40 micromètres placées sur un tube de centrifugeuse et recueillez la suspension de cinq des flacons en un seul tube.
Ensuite, centrifugez les échantillons pour combiner et diluer les échantillons tels qu’ils sont décrits dans le protocole de texte. Placez d’abord la toile de fromage dans un entonnoir au-dessus d’un flacon. Filtrer les mycélies préparées à travers le tissu et laver brièvement avec de l’eau déionisée.
Enlevez autant d’humidité que possible des mycélies en pressant la toile de fromage entre les mains et ensuite entre les serviettes en papier. Après cela, transférer les mycélies séchées sous forme de feuilles plates dans un bécher en plastique avec couvercle à vis. À l’aide d’azote liquide, congelez le mycélia flash et conservez-le à moins 80 degrés Celsius avant la lyophilisation.
Puis lyophiliser la mycélie du jour au lendemain. Le lendemain, arrêtez le processus de gel-séchage lorsque la température du mycélia reste constante. Retirer les beakers et les sceller immédiatement avec les bouchons à vis fournis.
Ajouter d’abord 1,5 gramme de mycélie et une boule de broyage dans le bocal de broyage d’un moulin à billes. Moudre la poudre mycéliale à 25 hertz pendant 30 secondes et transférer la poudre mycéliale dans un tube centrifugeuse de 15 millilitres. Inclinez le tube pour permettre le mélange ultérieur du mycélia avec le tampon, puis ajoutez six millilitres de tampon d’extraction glacée B250, y compris le cocktail inhibiteur de la protéase 1X, par gramme de poudre mycéliale et mélangez avec une petite spatule jusqu’à ce que l’homogénéisation complète de l’extrait brut soit atteinte; gardez le tube sur la glace pendant cinq minutes.
Ensuite, placez le tube et un tube d’équilibre dans une centrifugeuse et tournez à 40 000 fois g et à quatre degrés Celsius pendant au moins 20 minutes. Pendant la centrifugation, établissez une colonne de chromatographie jetable de 10 millilitres pour commencer à équilibrer la résine IgG. Pipette 300 microlitres de résine IgG bien résuspendue dans la colonne.
Remplissez la colonne à 10 millilitres avec B250 et laissez le tampon passer par gravité. Ajouter un millilitre de B250, y compris le cocktail inhibiteur de la protéase 1X et laisser couler à travers, puis brancher le bas de la colonne. Après la centrifugation, retirez 10 microlitres du supernatant pour l’analyse SDS-PAGE.
Placez l’échantillon dans un tube de 1,5 millilitre contenant 40 microlitres d’eau et 12,5 microlitres de 5X LSB. À l’aide d’une pipette sérologique, retirez soigneusement le supernatant et transférez-le sur la colonne contenant les perles IgG équilibrées. Fermez la colonne en sécurisant étroitement le bouchon d’extrémité fourni.
Pour commencer, incuber la colonne de chromatographie sur un mélangeur rotatif à 10 rpm et à quatre degrés Celsius pendant deux à quatre heures. Après cela, retirez le bouchon et ouvrez la colonne en bas pour recueillir le flow-through. Pour laver la colonne, utilisez un pipetter pour ajouter un millilitre de tampon de lavage 250 au bouchon de colonne pour enlever les perles piégées et transférer cette suspension en une seule chasse d’eau sur la résine réglée pour résusquer les perles.
Remplissez ensuite la colonne jusqu’au sommet avec le tampon de lavage 250 et fermez-la à l’aide d’un bouchon de pile relié à une pompe périssaliste. Démarrez la pompe périssaltique et réglez la pompe à un débit d’environ un à cinq millilitres par minute, répétez ce processus de lavage pour un total de quatre lavages, puis répétez ce processus de lavage trois fois à l’aide du tampon d’équilibrage TEV. Fermez la colonne de chromatographie en bas.
Resuspendez les perles IgG dans un millilitre de tampon de clivage TEV et ajoutez 20 microlitres de cocktail inhibiteur de protéase 50X ainsi que 10 microlitres de TEV. Capuchon suivant la colonne et incuber sur un mélangeur rotatif à 10 rpm et à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour élucider les complexes protéiques liés via le HDAC marqué. Le lendemain, ouvrez la colonne et recueillez l’élitate dans un tube de centrifugeuse de deux millilitres.
Utilisez 0,7 millilitres de tampon de clivage TEV pour enlever les perles du bouchon et rincer le mur de la colonne. Placez le tube de centrifugeuse de deux millilitres dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres, puis placez la colonne sur le tube ouvert de deux millilitres. Transférer tout cet assemblage sur une centrifugeuse de table et faire tourner à 300 fois g pendant deux minutes pour obtenir l’élucider TEV.
Dans cette étude, un enrichissement en une seule étape d’un HDAC de classe 1 tagué tap du champignon filamenteux Aspergillus nidulans est effectué pour l’évaluation de l’activité in vitro de deactylase. Un résultat typique de ceci illustre clairement l’efficacité de la première étape d’affinité, qui est encore plus augmentée en exécutant la purification de tandem. La plupart des protéines proéminentes présentes dans l’extrait de protéine et le flow-through, cependant, sont déjà épuisées dans l’allongement de TEV.
Un immunoblot montre des signaux forts migrent à environ 120 kilodaltons correspondant à la RpdA pleine longueur marquée par le CBP dans l’évadé TEV, le flow-through calmodulin, et les fractions eluate. Un essai représentatif d’activité de deactylase avec l’inhibiteur spécifique de HDAC Trichostatin A est montré ici. La sensibilité de l’activité confirme que les valeurs mesurées sont dues à la RpdA et non causées par une activité protéase non spécifique.
Ceci est important car il indique que la protéase TEV, qui est présente à une concentration assez élevée, n’interfère pas avec l’analyse d’activité HDAC. Fait intéressant, l’activité hdac est considérablement réduite après la deuxième étape de purification d’affinité, CE, par rapport à l’allongement de TEV. Afin de permettre une extraction efficace des protéines, assurez-vous que les mycélies sont broyées en poudre fine.
Ceci est particulièrement critique lorsqu’aucune machine n’est disponible et que le mortier et le pilon sont utilisés pour le broyage. L’ajout de la deuxième étape d’affinité au protocole se traduit par des fractions suffisamment pures pour l’identification des protéines, mais effectuées sur spectrométrie de masse. Lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide, assurez-vous de porter des lunettes de sécurité et des gants de protection pour éviter les blessures corporelles.
