Ce protocole est adapté à la production de diterpenoids purifiés qui peuvent être utilisés pour différentes analyses en aval et peuvent être personnalisés pour une gamme de différentes cibles métabolites. Le principal avantage de cette méthode est qu’il s’agit d’une méthode simple et peu coûteuse pour produire des quantités milligrammes de métabolites spécialisés. En échangeant les gènes et les enzymes utilisés pour la co-expression, cette méthode peut être modifiée pour produire d’autres terpétoïdes, y compris les monoterpénoïdes et sesquiterpenoids, ainsi que d’autres classes de métabolites tels que les flavonoïdes.
Pour la production et la transformation métaboliques des diterpénoïdes, commencez par réchauffer des cellules E.coli chimiquement compétentes sur la glace. Lorsque la culture a dégelé, ajouter 25 microlitres de cellules compétentes par construction à un microtube réfrigéré de 1,5 millilitre et ajouter 1 microlitre d’une solution de 100 nanogrammes par microlitre de chaque construction utilisée pour la co-expression. Incuber les mélanges sur la glace pendant 30 minutes avec un mélange doux toutes les 10 minutes en raclant les tubes sur un support de microtube.
À la fin de l’incubation, la chaleur choque les mélanges cellulaires à 42 degrés Celsius pendant une minute avant de remettre les cellules sur la glace pendant au moins deux minutes de plus. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de 37 degrés Celsius soc moyen aux tubes. Et incuber les cultures pendant une heure à 37 degrés Celsius et 200 rotations par minute.
À la fin de l’incubation, ajouter environ 10 perles de verre autoclavées et 100 microlitres de cellules à une plaque de lysogène réchauffée de 37 degrés Celsius avec les antibiotiques appropriés. Et secouez la plaque horizontalement avec le couvercle en place pour répartir uniformément les cellules. Ensuite, appuyez doucement sur les perles de verre dans un récipient à déchets et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit, côté surface enduit vers le bas.
Le lendemain, retirez la plaque de l’incubateur. Ajouter 5 millilitres de bouillon de lysogène fraîchement préparé avec les antibiotiques appropriés à un tube de verre stérile de 15 millilitres avec un bouchon respirant en plastique par culture prévue de 1 litre, et utiliser une pointe pipet pour choisir les colonies d’E.Coli transformées individuelles à partir de la plaque d’agar. Ajouter une colonie cueillie à chacun des tubes préparés de 15 millilitres et capuchon chaque tube avec le bouchon en plastique respirant qui l’accompagne.
Ensuite, placez les petites cultures e.coli plafonnées dans un incubateur de secousses de 37 degrés Celsius pendant 12 à 24 heures. Le lendemain ajouter 100 millilitres de 10x PBS à 900 millilitres de bouillon formidable dans un flacon de 1 litre par petite culture avec les antibiotiques appropriés. Et placez les flacons à 37 degrés Celsius et 140 rotations par minute pendant environ 30 minutes.
Lorsque le bouillon formidable est chaud, ajouter l’ensemble du volume de 5 millilitres de chaque culture d’inoculation à un flacon de culture de 1 litre par culture. Et placez les flacons dans l’incubateur secouant à 140 rotations par minute pendant environ 3 heures. Lorsque la densité optique à 600 nanomètres atteint 0,6, réduire la température de l’incubateur à 16 degrés Celsius.
Une fois l’incubateur refroidi, ajouter 1 millilitre d’un IPTG molaire, 1 millilitre d’acide aminolevulinique fraîchement préparé 4 grammes par litre de riboflavine et 1 millilitre d’acide aminolevulinique fraîchement préparé à chaque culture. Pour la production de diterpenoid, ajoutez 25 millilitres d’un pyruvate de sodium molaire à chaque culture pour assurer une formation suffisante de précurseurs. Ensuite, incuber les cultures à 16 degrés Celsius et 140 rotations par minute pendant 72 heures, en ajoutant 25 millilitres de pyruvate de sodium par jour aux cultures appropriées.
Pour la séparation et la purification des métabolites, fixez un entonnoir séparateur sur un support d’anneau dans une hotte de fumée. Et placez un conteneur à déchets sous l’entonnoir. Verser 500 millilitres d’une solution 50/50 d’acétate d’éthyle et d’hexanes dans l’entonnoir séparateur.
Et ajouter 500 millilitres de la culture transformée de co-expression E.coli d’intérêt dans l’entonnoir. Placez le bouchon de verre sur l’entonnoir et secouez l’entonnoir 5 à 10 fois pour mélanger la culture avec le solvant d’extraction, ouvrant fréquemment le spigot tandis que l’entonnoir est à l’envers et pointez-le dans le capot de fumée pour dégazer l’entonnoir. Après une deuxième série de secousses et de dégazage comme il vient de le démontrer, placez l’entonnoir droit dans le stand de l’anneau pendant environ une minute.
Lorsque la couche solvant supérieure s’est séparée de la couche de culture aqueuse, retirez le bouchon et égouttez la couche E.coli dans un bécher à déchets, en conservant la couche de solvant dans l’entonnoir. Ensuite, répétez l’extraction avec les 500 millilitres restants de la culture à l’aide des mêmes 500 millilitres de solvant utilisés pour la première extraction, avant de drainer le solvant contenant les métabolites extraits dans un flacon propre. Ici, notre chromatogramme représentatif de chromatographie de gaz-masse de spectrométrie des produits enzymatiques extraits typiques est montré.
Les sous-produits mineurs couramment observés comprennent le chloramphénicol et les dérivés de l’indole oxindole et le pivalaldéhyde indole. Après la purification diterpenoid par chromatographie de colonne de silice, trois composés de dolabralexin peuvent être obtenus, comme quantifié basé sur une courbe standard utilisant le sclareol diterpenoid. La chromatographie de la silice est idéale pour atteindre une grande pureté des composés cibles.
Puisqu’il permet la préparation simple des oléfines de diterpene et des dérivés oxygénés et enlève facilement l’oxindole contamine principal, qui est retenu sur la matrice de silice. En outre, la co-expression des gènes de la voie terpénoïde peut être utilisée pour produire des diterpenoids dans N.Benthamiana, résultant en la production de dolabradiene et 15, 16 époxydolabrene. Les solvants utilisés pendant l’extraction doivent être optimisés pour les propriétés chimiques physiques des métabolites d’intérêt et ne doivent pas être mélangeables avec de l’eau pour maintenir deux couches distinctes.
Après cette procédure, les métabolites purifiés peuvent être utilisés pour l’analyse en aval, y compris l’analyse structurale et les acides antibiotiques. Cette technique a permis la découverte de nouveaux diterpenoids, y compris ceux montrés ici, permettant à ces métabolites d’être analysés pour leur structure chimique et leurs nouvelles biactivités. Prenez des précautions lorsque vous utilisez des solvants organiques dans un entonnoir séparateur.
Assurez-vous toujours d’éliminer les déchets biologiques selon vos normes de sécurité de laboratoire.
