Drosophila sert de bon système modèle pour l’étude de la fonction mitochondriale. Ici nous présentons un protocole pour mesurer l’activité de synthase de citrate dans l’homogénéité de tissu des mouches adultes. Ce protocole ne nécessite pas l’isolement des mitochondries.
Il est rapide et simple et il convient pour mesurer l’activité de synthase de citrate dans les larves, les cellules de culture, et les tissus mammifères. Commencez par recueillir des mouches adultes pour chaque échantillon, en vous assurant de recueillir au moins des échantillons de triplicate pour chaque génotype. Préparez 500 microlitres de tampon d’extraction glacé avec HEPES de 20 millimlaires, EDTA millimolaire et X-100 triton de 0,1 % dans un tube à essai de 1,5 millilitre pour chaque échantillon.
Anesthésier les mouches adultes avec du dioxyde de carbone sur un tampon d’anesthésie. Pour isoler les thoraxes, fixez-les avec une paire de forceps et isolez les abdomens de mouche en coupant le long de la frontière du thorax et de l’abdomen avec une paire de ciseaux. Recueillir les thoraxes de mouche pour le test d’activité synthase citrate.
Transférez immédiatement 10 thoraxes adultes à 100 microlitres de tampon d’extraction glacée et homogénéisez-les avec un pilon sur la glace. Gardez les échantillons au froid en homogénéisant pendant cinq à dix secondes sur la glace, en les laissant reposer sur la glace pendant cinq secondes, puis en répétant jusqu’à ce que tous les tissus soient complètement homogénéisés. Aliquot 10 microlitres de chaque échantillon homogénéisé dans un nouveau tube pour la mesure de la teneur en protéines, en gardant ces tubes sur la glace ainsi.
Ajouter 400 microlitres de tampon d’extraction glacée à chaque échantillon restant pour un volume total de 500 microlitres et pipette de haut en bas doucement pour mélanger. Pour chaque réaction, ajouter un microlitre de lysate cellulaire dilué à 150 microlitres de la solution de réaction fraîchement préparée. Bien mélanger en pipetting doucement, en s’assurant d’éviter la formation de bulles, puis utilisez un lecteur de plaque pour mesurer l’absorption à 412 nanomètres toutes les 10 à 30 secondes pendant quatre minutes à 25 degrés Celsius.
Tracez les données comme absorbance au fil du temps, puis calculez la pente pour la partie linéaire de la courbe. Enfin, divisez le taux de réaction ou la pente par la concentration de protéines de l’échantillon pour normaliser l’activité de synthase du citrate. On a émis l’hypothèse que le renversement de dRNF34 dans le muscle de Drosophila augmenterait l’activité mitochondrique de synthase de citrate tandis que le knockdown de dPGC-1 renverserait cette augmentation.
Un taux enzymatique linéaire initial a été établi pour chaque analyse; les pentes des lignes de tendance représentent les taux de réaction maximaux qui sont équivalents aux activités maximales de synthase de citrate des différents génotypes. Les activités maximales de synthase de citrate ont été calculées à partir des courbes cinétiques et normalisées par concentration de protéines. Les résultats ont démontré que l’activité de synthase des thoraxes de mouche a en effet augmenté avec le knockdown de dRNF34 muscle-spécifique et l’augmentation a été renversée par le knockdown de dPGC-1 muscle-spécifique.
Lors de l’homogénéisation de l’échantillon, il est important de faire pencher le tube et de vérifier l’homogénéité pour s’assurer qu’il n’y a pas de caillots et que les tissus dans le tube sont complètement homogénéisés. Après la collecte de l’échantillon, tous les traitements de l’échantillon doivent être effectués sur la glace. L’analyse d’activité de synthase de citrate est employée pour quantifier la masse mitochondrique intacte.
La quantification appropriée de la masse mitochondrique intacte est très importante pour évaluer la fonction mitochondrique.
