Les écosystèmes côtiers et marins sont importants en tant que réservoirs, pour éliminer les nitrates des écosystèmes terrestres. Le nitrate dans le milieu aquatique peut être consommé par plusieurs processus simultanément. Comme la dénitrification, l’anammox et la DNRA.
Alors que des études antérieures ont montré que la DNRA est potentiellement coupable de dénitrification, les études mesurant l’activité de la DNRA sont encore très limitées par rapport à celles mesurant la dénitrification. Dans notre protocole, nous fournissons une procédure détaillée pour la mesure du taux potentiel de DNRA dans les échantillons environnementaux. Nous croyons que le taux potentiel de DNRA peut être calculé à partir de l’accumulation d’Ammonium étiquetéE N15 avec ajout de nitrate étiqueté N15.
L’avantage de notre méthode par rapport à d’autres méthodes, c’est que l’ammonium est finalement converti en oxyde nitreux, qui a un faible fond atmosphérique. En outre, il n’est pas sage que nous avons mesuré l’oxyde nitreux par spectromètre de masse de chromatographie de gaz quadrupole. Ce qui est moins coûteux et facile à gérer qu’un spectromètre de masse à ratio isotopique.
Tout d’abord, placez un morceau de ruban PTFE de 60 millimètres sur une petite feuille de papier d’aluminium. Cendres d’un filtre en fibre de verre à 450 degrés Celsius pendant quatre heures dans un four à silencieux. Placez ensuite le filtre en fibre de verre un peu au-dessus du point médian de l’axe plus long de la bande.
Ensuite, placez 20 microlitres de 0,9 grains de beauté par litre d’acide sulfurique au centre du filtre en fibre de verre, et pliez immédiatement le ruban PTFE à l’aide d’un timbre plat et d’une pince à épiler droite. Retournez le ruban PTFE sur le filtre en fibre de verre, puis scellez les deux côtés du ruban PTFE en pliant, puis en appuyant hermétiquement sur le bord avec les pinces à épiler. À l’aide de la pince à épiler, pliez l’extrémité ouverte de la bande PTFE et appuyez sur le bord.
Sceller l’extrémité ouverte du ruban PTFE en appuyant hermétiquement sur le bord avec les pinces, en prenant soin de ne pas appuyer sur le filtre en fibre de verre. Transférer 30 milligrammes d’oxyde de magnésium ashed, à un flacon de verre de 20 millilitres, et placer l’enveloppe PTFE dans le flacon. Transférer cinq millilitres d’un échantillon ou d’une norme préalablement préparé dans le flacon contenant l’oxyde de magnésium et l’enveloppe PTFE.
Et fermez immédiatement le flacon avec un bouchon en caoutchouc gris butyl. Ensuite, sceller le flacon avec un bouchon d’aluminium. Secouez les flacons à 150 rPM pendant trois heures à quatre degrés Celsius dans des conditions sombres.
Par la suite, retirez le bouchon d’aluminium et le bouchon en caoutchouc butyl de chaque flacon. Retirez l’enveloppe PTFE de chaque flacon à l’aide d’une pince à épiler pointée et rincez soigneusement l’enveloppe et les pinces à épiler avec de l’eau échangée par ion. Ensuite, essuyez l’enveloppe et la pince à épiler avec du papier essuyant, et placez l’enveloppe sur du papier essuyant frais.
Ouvrez l’enveloppe PTFE avec des pinces à épiler plates et pointues dans l’ordre inverse des marches pliante. À l’aide de pinces à épiler plates, maintenez la zone périphérique du filtre à fibres de verre, où l’acide sulfurique est censé ne pas être tamponné. Et transférez-le dans un tube à essai de bouchon à vis de 11 millimètres.
Rincer les pinces à épiler avec de l’eau échangée par ion et essuyer avec du papier essuyant. Ajouter un millilitre d’eau échangée par ion à chaque tube à essai. Fermez les tubes à essai avec des bouchons à vis doublés PTFE, et laissez-les reposer pendant au moins 30 minutes à température ambiante, pour échapper complètement à la cation d’ammonium du filtre à fibre de verre.
Par la suite, ouvrez le bouchon de vis, ajoutez deux millilitres d’un réaccente de solution oxydante de persulfate préalablement préparée au tube à essai, et fermez le tube étroitement avec un bouchon de vis, pour éviter toute perte ou contamination pendant les étapes suivantes. Tenez les tubes à essai sur une grille, enveloppez-les dans du papier d’aluminium à double couche et autoclavez-les en position verticale pendant une heure à 121 degrés Celsius. Mélanger 100 millilitres de tampon stérile de 40 millimoles par litre de phosphate tampon, et 100 millilitres de stériles 30 millimoles par litre de glucose aseptique.
Ajouter un stock de glycérol de P.chlororaphis à 200 millilitres de la solution de glucose tamponné phosphate, dans un flacon Erlenmeyer de 300 millilitres. Et purger avec un flux d’hélium ultra pur pendant une heure. Ensuite, distribuez deux millilitres d’une suspension de dénigrement préparée précédemment en flacons de cinq millilitres.
Capuchon chaque flacon avec un bouchon en caoutchouc gris butyl, et une fermeture en aluminium. Remplacer l’air headspace par de l’hélium ultra pur, en aspirant pendant trois minutes et en chargeant l’hélium pendant une minute. Réglez la pression positive du gaz Headspace à 1,3 atmosphère, afin d’éviter la contamination involontaire de l’air.
Injecter un millilitre d’échantillon ou de série à travers le bouchon en caoutchouc butyl, à l’aide d’une seringue jetable d’un millilitre. Puis, incuber les flacons pendant la nuit à 25 degrés Celsius, dans des conditions sombres. Le lendemain, injectez 0,3 millilitres de six grains de beauté par litre d’hydroxyde de sodium pour arrêter la dénitrification et absorber le dioxyde de carbone Headspace, ce qui perturbera autrement l’analyse de l’oxyde nitreux.
Parce que le dioxyde de carbone et l’oxyde nitreux ont le même poids moléculaire. Déterminer les quantités d’oxyde nitreux avec un poids moléculaire de 44, 45 et 46, dans le gaz Headspace à l’aide d’un quadrupole GC/MS avec un port d’injection modifié. Les résultats représentatifs ont été obtenus à partir de 15 expériences de traçage de l’azote des sédiments des marais salants créés à partir du grand tremblement de terre de l’est du Japon en 2011 dans la zone lunaire de la ville de Kesennuma et de la préfecture de Miyagi, au Japon.
Une augmentation de la concentration d’ammonium étiqueté tout au long de la période d’incubation a été observée pour tous les sédiments recueillis dans les zones subtidales et intertidales. Les taux de la DNRA se trouvaient entre 24,8 et 177. Et sont comparables aux valeurs rapportées dans les études précédentes, mais plus élevées que les valeurs dérivées d’environnements similaires.
Le taux élevé de DNRA, peut s’expliquer par le marais salé utilisé comme champ de culture avant le tremblement de terre. Conformément à la spéculation, le taux de DNRA dans la zone intertidale, qui est riche et organique composés par rapport à la zone subtidale, était plus élevé. Notre protocole est largement applicable à l’analyse des voies métaboliques, qui implique la formation d’ammonium et les ajouts de traces N15.
