Dans cette revue, nous discuterons des techniques d’imagerie et biochimiques utilisées pour étudier le positionnement et la composition d’organelle, aussi bien que des réarrangements de cytosquelette observés pendant la formation d’une synapse immunologique. Les étapes initiales du remodelage actif permettent aux cellules B d’augmenter la surface de leur cellule et de maximiser la quantité de complexes d’antigène BCR réunis à la synapse. D’autre part, le recrutement local de lysosomes, ainsi que le centrosome à la membrane synaptique, peut être couplé à la sécrétion de lysosome, qui est connu pour faciliter l’extraction des antigènes immobilisés.
L’antigène adopté est encore traité dans des compartiments endolysosome dans des peptides, qui sont chargés sur des molécules de classe II de MHC pour la présentation aux cellules d’aide de T. Par conséquent, l’étude de la dynamique organelle associée à la synapse immunitaire est cruciale pour comprendre comment les cellules B sont pleinement activées. L’immunofluorescence des cellules B activées par des antigènes immobilisés nous permet de suivre différents composants cellulaires et comment ils peuvent être recrutés dans la synapse immunitaire.
Les cellules B peuvent être activées par des antigènes immobilisés à la surface d’une perle ou d’une surface de couverture. Les perles enduites d’antigène sont préparées en incubant des ligands spécifiques avec des perles d’aminés précédemment traitées avec du glutaraldehyde pour activer les groupes aminés. Resuspendez les perles activées dans 100 microlitres de PBS et de vortex.
Pendant ce temps, préparer la solution antigène en ajoutant 100 microgrammes par mL de ligand BCR dans 150 microlitres de PBS. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de perles activées à la solution antigène et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Rappelez-vous, utilisez également un ligand sans rapport comme contrôle négatif.
Après l’incubation, laver les perles avec du PBS. Aspirer le supernatant et remplacer par PBS. Répétez trois fois.
Ensuite, bloquez les trois groupes d’acides aminés par des perles résuspendues dans 500 microlitres d’une solution de BSA. Enfin, resuspendez les perles dans 70 microlitres de PBS. Pour calculer la concentration finale, vous pouvez utiliser un hémocytomètre pour compter les perles.
Pour l’activation des cellules B, utilisez un tube de 50 mL et résuspendez les cellules à une concentration de 1,5 million par mL en CLICK complétée par 5% de sérum bovin fœtal. Ensuite, ajoutez 150 000 cellules B, correspondant à 100 microlitres du mélange de perles cellulaires à une annonce de coverslip recouverte de poly-L-lysine incuber à 37 degrés pour les différents points de temps. Une deuxième approche pour activer les cellules B consiste à les ensemencer sur des couvre-clés recouverts d’antigènes.
À cette fin, le pelage glisse avec anti-BCR et B220 avec améliore l’adhérence cellulaire. Préparer la solution antigène en ajoutant des anti-BRC et B220 dans PBS à une concentration finale de 10 microgrammes par mL et 0,5 microgramme par mL, respectivement. Ensuite, placez le coverslip sur un couvercle de 24 plaques bien recouvertes de film parafilm et ajoutez 40 microlitres de solution antigène.
Sceller la plaque, puis incuber à 4 degrés pendant la nuit. Pour commencer l’activation dans coverslip, lavez-les d’abord avec PBS et laissez-les sécher pendant quelques minutes. Ensuite, ajoutez 150 000 cellules B et incubez à 37 degrés pour les différents points de temps.
Dans les deux cas, lors de l’activation soit avec des perles ou des glissières enduites d’antigène, nous vous recommandons de commencer par le point de temps le plus long, puis de passer à ceux plus courts. Une fois que vous avez monté le coverslip sec sur la glissière de microscope, vous pouvez utiliser une épifluorescence ou un microscope confocal pour visualiser vos échantillons, selon les exigences de résolution. Concentrez l’échantillon à l’aide de la lumière transmise.
Vous devriez rechercher des champs où les cellules et les perles interagissent à un et un rapport. Pour les cellules B activées sur les coverslips recouverts d’antigènes, utilisez l’objectif 100x pour une meilleure résolution. Pour les paramètres, envisagez de prendre une pile z qui couvre l’ensemble de la cellule.
Vous pouvez étiqueter l’actine pour délimiter les limites inférieure et supérieure de la cellule. Pour les cellules B activées avec des perles enduites d’antigène et l’étiqueter pour les organites confinés à un point, délimitez d’abord deux zones : la zone cellulaire et la zone de perle. Ensuite, identifiez la position ou l’organelle par un point et obtenez ses coordonnées de localisation.
Dessiner deux vecteurs: l’un entre le centre cellulaire et l’organelle, et l’autre entre le centre cellulaire et le centre de perles. Mesurez la longueur des deux et mesurez l’angle entre les deux vecteurs, maintenant appelé alpha. Faites une projection avec le vecteur entre le centrosome et le centre cellulaire à l’aide du Guassian de l’alpha, puis calculez l’indice de polarité de l’organelle en divisant le vecteur projeté, a, par b.
Ainsi, un indice de polarité entre zéro et un indique un phénotype polarisé. Les valeurs comprises entre zéro et moins un indiquent un phénotype non polarisé. Afin de déterminer l’indice de polarité pour plus d’organites de dispersion, tels que les lysosomes, vous pouvez utiliser le même algorithme mentionné précédemment, en changeant les coordonnées de localisation organelle pour les coordonnées du centre de masse des étiquettes, dans ce cas, les lysosomes.
De même que l’analyse décrite précédemment, un indice de polarité entre zéro et un indice indique un phénotype polarisé, tandis que les valeurs entre zéro et moins un indiquent un phénotype non polarisé. Pour quantifier la quantité de chaque organite étroitement recrutée dans la nouvelle synapse, vous pouvez calculer le pourcentage de fluorescence organelle à la perle. Pour cela, vous devez délimiter la zone de la perle et des cellules, mesurer l’intensité de fluorescence respective, puis diviser la fluorescence perlée par la somme de la perle et la fluorescence cellulaire.
Vous obtiendrez la quantité de chaque organelle qui est en contact avec la nouvelle synapse. Sinon, dessinez un rectangle en face de la perle. Utilisez un poids correspondant à un quart de la longueur de la cellule, puis mesurez l’intensité de fluorescence dans le rectangle et divisez-le par la fluorescence totale.
Cet algorithme permettra toujours d’obtenir le pourcentage de l’organelle qui est proche de la nouvelle synapse, mais pas nécessairement en contact direct avec l’interface. Quantifier les composants associés au centrosome dans les cellules B au repos et activées. En bref, nous déterminons trois paramètres.
La cellule et la zone de perle, et les coordonnées de localisation centrosomal. Ensuite, nous définissons un cercle entourant le centrosome et exécuter une analyse de profil radial à partir du centre du centrosome, précédemment défini. Une fois que vous avez la parcelle, déterminez le rayon auquel 70% de la fluorescence maximale est maintenue.
Utilisez ce rayon pour dessiner un cercle autour du centrosome. Enfin, obtenir la densité de fluorescence de la composante d’intérêt à la zone centrosome et la zone cellulaire, et diviser les deux valeurs pour obtenir le rapport de densité fluorescente. Pour mesurer la distribution des organites à l’interface synapse immunitaire, identifiez d’abord la zone des cellules B en contact avec le coverslip enduit d’antigène.
Vous pouvez étiqueter actin pour vous aider à définir cette zone. Ensuite, mesurez la zone en contact avec la lame, la hauteur et la largeur de la cellule. La zone faisant face au glissement de couverture enduit d’antigène est une mesure de la cellule B se propageant lors de l’activation des cellules B.
Utilisez les valeurs de hauteur et de largeur pour délimiter une zone centrale de la cellule, qui est séparée des limites par un quart de la hauteur et les valeurs de largeur. Habituellement, ceux-ci correspondent à environ un tiers de la zone cellulaire totale. Enfin, calculer le recrutement d’organite au centre de la nouvelle synapse, en divisant la densité de fluorescence à la zone centrale par la densité de fluorescence de l’ensemble de la cellule.
Les valeurs positives de cet indice indiquent un enrichissement d’organite au centre de la nouvelle synapse. Au contraire, les valeurs négatives indiquent une distribution périphérique. Mesurer la distribution des organites à travers les z-planes des cellules B activées sur les coverslips enduits d’antigènes, d’abord délimiter l’interface synaptique et la limite supérieure de la cellule.
Ensuite, tracez une ligne à travers le centre cellulaire et reslice l’image pour obtenir une image XZ. Mesurez la tête de la cellule et divisez l’image en 10 fractions de la même zone, de la synapse immunitaire à la limite supérieure de la cellule. Mesurez la fluorescence dans chaque fraction z et calculez le pourcentage de fluorescence en divisant la fluorescence à chaque fraction z par la fluorescence totale de la cellule.
Enfin, tracez le pourcentage d’intensité de fluorescence par fraction z. Les fractions 1 et 2 représentent l’interface synaptique. Voici le flux de travail ou la procédure d’isolement centrosome.
Utilisez 20 millions de cellules B par condition. Pré-traiter les cellules avec cytochalasine D et Nocodazole selon le protocole requis pour faciliter le détachement centrosome. Ensuite, observez les cellules en les réutilisant dans 5 mL de tampon tbs.
Répétez en utilisant 1 mL de tampon TBS de 0,1 x complété par 8% de saccharose. Resuspendez la pastille cellulaire avec 150 microlitres de tampon de lyse. Centrifugeuse à 10 000 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius pour séparer le cytosol et les organites du noyau.
Récupérer soigneusement le surnatant cellulaire et le placer sur un tube de 1,5 mL. Remplissez-le de 300 microlitres de tampon de gradient complétés par 60% de saccharose. Centrifugeuses à 10 000 g pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius.
Cette étape de centrifugation est importante pour concentrer les centrosomes. Après centrifugation, retirez soigneusement le supernatant jusqu’à ce que vous atteigniez l’interface. Vortex l’échantillon restant dans le tube.
Préparer le gradient de saccharose discontinu dans un tube d’ultracentrifugeuse en superposant 0,45 mL de saccharose à 70 %, avec 0,27 mL de saccharose à 50 %, puis 0,27 mL de saccharose à 40 % dans le tampon de gradient. Placez les échantillons enrichis en centrosome sur le gradient discontinu et calibrez le poids de chaque échantillon dans les adaptateurs respectifs. Centrifugez les tubes à 40 000 g pendant 1 heure à 4 degrés Celsius, avec une accélération minimale et sans rupture pour éviter de perturber le gradient.
Après centrifugation, recueillir soigneusement 12 fractions avec un volume égal. Resuspendez l’échantillon avec le tampon de chargement et exécutez un SDS-PAGE. Pour étudier la distribution d’organite dans les cellules B pendant la formation d’une synapse immunitaire, nous avons utilisé des cellules 2A1.6 B activées avec des perles enduites d’antigène pour différents points de temps.
Comme contrôle, les cellules B ont été activées avec des perles contenant un BCR-ligand indépendant. Nous détectons alors, à l’aide de taches d’immunofluorescence, différents organites, qui modifient leur localisation lors de l’activation avec des antigènes immobilisés. Nous montrons ici le centrosome, étiqueté avec alpha-tubulin et appareil golgi étiqueté avec Rab6a.
Dans le graphique, nous montrons l’indice de polarité pour la polarité de l’appareil centrosome et golgi verus à chaque point d’activation, dans lequel chaque point représente une cellule. Au cours de l’activation, on peut observer que les indices de polarité de ces organites atteignent des valeurs proches de 1, suggérant une augmentation de leur recrutement à l’IS.Organelles qui affichent une distribution plus dispersée, comme les lysosomes, peuvent également être quantifiées à l’aide d’un indice de polarité. Nous pouvons observer que l’indice de polarité du lyososome atteindra des valeurs plus positives lors de l’activation, ce qui résulte du recrutement à l’IS. Nous montrons une approche complémentaire pour quantifier le recrutement d’un lysosome vers la synapse immunitaire.
En utilisant le même protocole d’activation avec des perles enduites d’antigène, le recrutement de lysos à l’IS a été calculé en quantifiant l’étiquette de fluorescence des lyosomes recrutés dans la zone définie autour de la perle ou dans la zone synaptique. Nous pouvons observer cette activation ouverte. Il y a une augmentation des lysosomes couplée au site de synapse.
Ici, nous présentons la quantification de l’actine au centrosome dans les cellules B activées avec des perles spécifiques et non spécifiques enduites d’antigène. Le pool d’actine est indiqué avec une flèche. La quantification des composants associés au centrosome, comme l’actine dans ce cas, peut être représentée par une parcelle de points, dans laquelle chaque point représente une cellule.
Après l’activation, la cellule B diminue de la quantité d’actine autour du centrosome. Cette étape est importante pour détacher le centrosome de la région périnucléaire pour permettre sa polarisation à la nouvelle synapse. Pour la cellule B activée sur la surface enduite d’antigènes, vous pouvez étudier le remodelage de l’actine ainsi que le recrutement d’organites à la membrane synaptique.
Ici, nous montrons l’analyse des organites, tels que l’appareil golgi et le réticulum endoplasmique, qui affichent une distribution centrale et périphérique, respectivement. En outre, nous pouvons calculer la zone de propagation des cellules B après différents points de temps d’activation. À cette fin, nous étiquetons actin pour être en mesure de définir la limite cellulaire dans le plan XY.
Dans le graphique, vous pouvez observer l’augmentation de la zone cellulaire après 30 et 60 minutes d’activation. La distribution d’un organite peut également être calculée dans le plan XZ en respectivement à l’interface synaptique. Le graphique représente la distribution de l’actine en z-plane, où les deux premiers plans correspondent à l’interface synaptique.
Nous pouvons observer que l’actine s’enrichit dans ce domaine lors de l’activation. En plus de l’analyse d’imagerie, l’approche biochimique peut également être employée pour étudier le changement dans la composition centrosome sur l’activation de cellules de B. Nous montrons ici une tache occidentale représentative de fraction centrosome-contenant soulignée par le rectangle beige.
Des fractions centrosome ont été isolées sur un gradient discontinu de saccharose et détectées par nivellement gamma-tubulin. La tache occidentale ci-dessous montre l’actine et l’Arp2 dans les fractions centrosome des cellules B au repos, qui s’épuisent lors de l’activation. Les lymphocytes B subissent des changements dynamiques à l’interface membranaire afin de former une synapse immunitaire fonctionnelle.
Ce processus peut être étudié par imagerie et techniques biochimiques décrites ici dans cette vidéo. Nous croyons que cette analyse peut fournir des informations de valeur sur les mécanismes moléculaires impliqués sur la façon dont les cellules B peuvent être activées efficacement.
