Notre protocole décrit des méthodes pour interférer efficacement avec le chiffre d’affaires autophagique induit par HSV-1 dans les cellules dendritiques. Et en particulier, nous comparons un inhibiteur basé avec une stratégie basée sur le siRNA pour bloquer l’autophagie avant l’infection. Bien que l’interférence basée sur les inhibiteurs avec l’autophagie comporte des effets potentiels et spécifiques hors cible, notre stratégie développée basée sur le siRNA est plus spécifique à la cible.
Fait important, les deux techniques présentées n’affectent pas les stades de maturation de la maladie. Petra Muhl-Zurbes, technicienne, et Alexandra Duthorn, étudiante diplômée, de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Commencez par récolter des cellules dendritiques immatures ou des iDC en rinçant doucement les cellules lâchement adhérentes du fond du flacon de culture cellulaire le quatrième jour après l’adhérence.
Ajoutez un cocktail de maturation aux cellules pour générer des cellules dendritiques matures ou des MDC. Deux jours après l’induction de la maturation, rincer les mDC à partir du fond de la fiole de culture cellulaire. Répétez le rinçage deux fois, puis transférez les iDC et les mDC dans des tubes de 50 millilitres dans leur milieu de culture respectif.
Récolter les cellules par centrifugation à 300 fois g pendant cinq minutes. Resuspendez doucement les cellules en cinq à 10 millilitres de RPMI 1640 par flacon de culture cellulaire et combinez les suspensions DC respectives dans un tube. Quantifiez ensuite les cellules à l’aide d’une chambre de comptage en vous assurant d’éviter les changements de température lors de la manipulation des CD.
Transférer deux millions d’iDC ou de mDC dans un tube de deux millilitres, les centrifuger à 3 390 fois g pendant 1 1/2 minute et jeter le supernatant. Doucement, le resuspendre les cellules dans le milieu de l’infection. Inhiber la voie de dégradation lysosomale autophagosomale en ajoutant 10 spautin-1 micromolaire ou un micromolaire bafilomycine A1 au milieu de l’infection une heure avant l’infection.
Ajouter DMSO pour le contrôle non traité et incuber les cellules sur un bloc chauffant à 37 degrés Celsius avec secousses à 300 RPM. Pour les études d’infection, inoculer les cellules avec des virions HSV-1 à une multiplicité d’infection de deux. Ajouter le volume respectif de tampon MNT comme un simulacre de contrôle et d’incuber les cellules sur un bloc chauffant à 37 degrés Celsius pendant une heure avec des secousses.
Une heure après l’infection, recueillir les cellules par centrifugation à 3390 fois g pendant 1-1/2 minutes, puis aspirer l’inoculum doucement et resuspendre les cellules dans dc moyen. Maquette de graines traitée et cellules infectées par le HSV-1 à une concentration finale d’un million de cellules par millilitre dans une plaque de six puits. À 16 à 24 heures après l’infection, récoltez les iDC à l’aide d’un grattoir cellulaire ou de mDC en rinçant, transférez les cellules dans un tube de verrouillage sécuritaire de 1,5 millilitre et recueillez-les par centrifugation à 3 390 g pendant 1 1/2 minutes.
Répétez la récolte et la centrifugation avec les cellules restantes dans les puits, puis lavez la pastille une fois avec un millilitre de PBS et résépendez vigoureusement les cellules dans le mélange de lyse. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis chauffer à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Effectuez l’analyse de la page SDS et de la tache occidentale pour vérifier les niveaux de protéines LC3B1 et LC3B2, P62, ICP0 et ICP5, et GAPDH.
Le jour 3.5 après l’adhérence, transférer 12 millions d’iDC dans un tube de 50 millilitres, les centrifuger à 300 fois g pendant cinq minutes, puis jeter le supernatant. En parallèle, effectuez une analyse cytométrique du débit pour surveiller l’état de maturation. Lavez doucement les iDC en cinq millilitres d’Opti-MEM sans phénol rouge et centrifugez-les à 300 fois g pendant cinq minutes.
Jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans 200 microlitres d’Opti-MEM ajustant la concentration cellulaire à six millions de cellules pour 100 microlitres. Ajouter 75 picomoles de siRNA spécifique ou brouillé FIP200 à quatre électrocuvettes millimétriques et transférer 100 microlitres de la suspension cellulaire dans la cuvette respective. Pulsez directement les iDC à l’aide d’un appareil d’électroporation.
Après l’électroporation, transférer les iDC dans des plaques de six puits avec un milieu de DC frais préchauffé, ensemencer les cellules à une concentration finale d’un million de cellules par millilitre et les placer dans l’incubateur. Après 48 heures, examiner la morphologie des iDC électroporés au microscope, puis récolter les cellules avec le grattoir cellulaire et les transférer dans des tubes de 15 millilitres. Rincer les puits avec un millilitre de PBS complété par 0,1%EDTA et transférer la solution dans les tubes respectifs.
Ensuite, divisez les cellules pour chaque condition de siRNA comme décrit dans le manuscrit. Utilisez 500 000 cellules pour évaluer l’état de maturation et la viabilité des cellules, utiliser un million de cellules pour l’analyse des taches occidentales pour vérifier l’efficacité de knockdown spécifique fip200 et utiliser les cellules restantes pour les expériences d’infection HSV-1. Les iDC et les MDC générés ont été phénotypiquement analysés par cytométrie de flux afin d’exclure la contamination par d’autres types de cellules et de vérifier leur état de maturation.
Les cellules ont été tachées d’anticorps CD3 et CD14 pour exclure la contamination des lymphocytes T et des monocytes respectivement. Les cellules ont été tachées pour CD11c qui sert de marqueur général fortement exprimé pour les CD. Pour évaluer l’état de maturation, des anticorps CD80, CCR7, CD83 et MHCII ont été utilisés parce que ces molécules sont fortement exprimées sur les CD matures.
La microscopie de fluorescence et la cytométrie d’écoulement ont été employées pour déterminer l’infection avec EGFP exprimant HSV-1. Les signaux GFP forts indiquent une infection presque complète des IDC et des MDC. L’analyse occidentale de tache a été employée pour déterminer si la spautin-1 ou la bafilomycine A1 inhibent le flux autophagique dans les cellules infectées de HSV-1.
Dans les iDC, le flux autophagique est démontré par le déclin de l’expression P62 et LC3B en l’absence respectivement de spautin-1 et de bafilomycine A1. En revanche, l’infection de HSV-1 des mDC en l’absence de spautin-1 n’affecte pas l’expression de P62 tandis que le traitement de spautin-1 et de BA1 a induit une accumulation de LC3B-II qui reflète l’induction de l’autophagie mais un échec du chiffre d’affaires autophagique dans les MDC. La réduction des niveaux de protéine FIP200 avec électroporation de siRNA provoque également une forte diminution du flux autophagique dans les iDC infectés par le HSV-1.
Ce protocole d’électroporation basé sur le siRNA pour l’inhibition de l’autophagie n’affecte pas la viabilité cellulaire, le phénotype d’image ou l’établissement de l’expression de protéine HSV-1 dans les iDC. Nos protocoles d’électroporation offrent la possibilité de fournir des espèces distinctes d’ADN ou d’ARN dans la maladie et d’autres types de cellules primaires. Par la suite, une variété d’analyses moléculaires, fonctionnelles et d’infection peuvent être exécutées.
La stratégie basée sur le siRNA pour le silencing d’expression dans la maladie ouvre la voie à explorer la fonction de n’importe quelle protéine d’intérêt, également combinée avec des analyses fonctionnelles suivantes.
