Ce protocole démontre comment la microscopie In Vivo Two-Photon peut être utilisée pour faire une visualisation répétitive de la dynamique cellulaire, au même endroit du cerveau sur de longues périodes de temps. L’avantage de cette technique est que, il permet d’imager les changements à long terme dans les éléments cellulaires du cerveau, y compris l’arrangement, la morphologie, et les interactions physiques entre différents types de cellules du SNC. Cette technique peut être particulièrement utile pour obtenir des interactions cellule-cellule, la dynamique cellulaire, et les changements morphologiques pendant la plasticité du cerveau, et la neurodégénérescence.
Commencez par préparer un jeune ou un jeune adulte, de quatre à dix semaines, une souris hétérozygote CX3CR1 GFP, qui pèse de 17 à 25 grammes, pour une implantation crânienne de fenêtre. Après anesthésier la souris, utilisez une tondeuse à cheveux pour raser les cheveux sur sa tête, entre les oreilles, approximativement, du niveau des yeux, au sommet de la région du cou. Déplacez la souris à la station de chirurgie stéréotaxique, cône du nez, et stabiliser sa tête à l’aide de barres d’oreille.
Maintenez la souris sur le coussin chauffant, tout au long de la procédure. Lubrifier les deux yeux avec de l’onguent à l’huile, puis injecter 100 microlitres de 0,25% bupivacaine, et 100 microlitres de quatre milligrammes par millilitre dexaméthasone, sous-cutanée au site d’incision. Attendez au moins cinq minutes avant de procéder.
Saigner la tête rasée, avec trois écouvillons alternatifs de bêtadine, et 70% d’alcool. Ensuite, faites une incision du cuir chevelu de ligne médiane avec une lame chirurgicale ou des ciseaux. S’étendant de l’arrière de la région du crâne, entre les oreilles, à la zone frontale entre les yeux.
Couper le reste de la peau pour exposer le crâne. Saigner le tissu conjonctif situé entre le cuir chevelu et le crâne sous-jacent avec 3% de peroxyde d’hydrogène, et de localiser la zone du cerveau pour être photographié avec des coordonnées stéréotaxiques. Percer une ouverture circulaire, d’environ quatre millimètres dans le crâne, à l’aide d’un foret dentaire.
Pendant le forage, humidifiez régulièrement le crâne avec des salines stériles et des cotons-tiges pour refroidir le cerveau. Dégagez les débris osseux et adoucissez l’os du crâne. Une fois terminé, retirez soigneusement cette partie du crâne avec des forceps pointus.
Après l’enlever du crâne, placez soigneusement un petit verre de couverture, humidifié avec de la solution saline dans la craniotomie. Sécher l’excès de solution saline à l’aide d’un lingette stérile. À l’aide d’un applicateur pointu, appliquer de la colle cyanoacrylate autour de la fenêtre et lui permettre de s’attacher au cerveau et au crâne.
Appliquer la colle d’amorce sur le reste du crâne, et le guérir avec une lumière de séchage pendant 20 à 40 secondes. Créez un puits autour de la fenêtre avec la colle finale, et guéris-le avec une lumière de séchage pendant 20 à 40 secondes. Collez une petite plaque de tête sur le crâne, sur l’hémisphère contralatéral, la craniotomie, avec la colle d’amorce, puis avec la colle finale, guérissant les deux pendant 20 à 40 secondes.
Après le réveil de la souris, injecter une dose sous-cutanée de buprénorphine SR comme analgésie postopératoire, ce qui sera suffisant pendant 72 heures. Faites revivre la souris avec des aliments salés supplémentaires pour faciliter une récupération saine. L’imagerie peut être effectuée dès deux semaines après la chirurgie d’implantation.
Utilisez des vis pour monter la plaque de tête sur le stade microscope à deux photons, qui doit être maintenu à 35 degrés Celsius avec une plaque chauffante. Injecter la souris sous-cutanée avec 100 microlitres de colorant des vaisseaux sanguins, tels que rhodamine B.Doucement nettoyer la surface de la fenêtre crânienne avec un coton-tige, tamponné dans 70% d’éthanol. Mettez quelques gouttes d’eau ou saline sur la fenêtre, et abaissez la lentille objective dans la solution.
Assurez-vous que le laser est éteint pendant que l’objectif est en baisse, et dessinez une carte de cours pour indiquer les repères principaux de vaisseau sanguin, tout en regardant par l’oculaire. Utilisez ce dessin pour identifier les régions spécifiques lors de l’imagerie à deux photons. Recueillir des images de cellules fluorescentes et de vaisseaux à l’aide de l’imagerie à deux photons.
Consultez le manuscrit du texte pour les paramètres d’imagerie, prenez des notes prudentes avec les coordonnées appropriées, pour vous assurer que les régions précises peuvent être revisitées pour une imagerie ultérieure. Dessiner comme plusieurs champs de vision dans cette première séance d’imagerie, À la fin de l’imagerie, enlever la souris de la scène, lui permettre de se réveiller de l’anesthésie, et le retourner à sa cage d’origine. Utilisez les notes et images obtenues pour ré-imagerie des zones lors des sessions suivantes.
Ce protocole a été utilisé pour visualiser la dynamique microgliale in Vivo, chez les souris de ligne YFP-H de Taiwan. Dendrites spécifiques, a servi de repères stables pour la cartographie fine des régions du cerveau. Alors que les dendrites sont stables, certaines microglies se déplacent quotidiennement.
Des souris transgéniques simples de CX3CR1/GFP, ont été employées pour suivre des microglies pendant jusqu’à huit semaines. Des injections de rhodamine B, ont été employées pour étiqueter la vascularisation, pendant chaque session d’imagerie. Alors que la vascularisation reste stably fixe, les microglies sont dynamiques.
Les souris CX3CR1/GFP, ont été employées pour suivre des microglies avant et après des saisies graves. La structure vasculaire de lit a été maintenue, mais le réseau cellulaire microglial, et le paysage de position était transitoire. Des changements plus importants ont été observés dans les 24 à 48 heures suivant les crises.
Double transgénique CX3CR1/GFP et NG2DS-Red souris, ont été utilisés pour suivre les microglies, et NG2 à des cellules positives In Vivo. Sans étiqueter la vasculature, les microglies ainsi que les parasites associés aux vaisseaux, et les cellules précurseurs des oligodendrocytes, ou OPCs, ont été identifiés. Les parasites ont des processus allongés qui suivent le long de la paroi vasculaire, et les OPCs montrent généralement de plus grands corps cellulaires qui résident dans le parenchyme cérébral, loin de la vascularisation.
Quand rhodamine B a été employé, la fluorescence plus lumineuse des parasites pourrait être distinguée de la fluorescence plus faible de rhodamine luminal, en dépit de l’excitation semblable pendant l’imagerie. L’imagerie quotidienne a montré que les parasites étaient bien positionnés, tandis que les OPC et les microglies étaient dynamiques. Il est important de faire une observation attentive de la zone en cours de visualisation, de dessiner une carte représentative aussi précise que possible et de désigner les mesures prises pour atteindre les autres endroits en ce qui concerne le point de départ.
Lors des séances d’imagerie subséquentes, ces étapes, les cartes dessinées à la main et les images précédemment prises seront essentielles pour identifier les mêmes endroits à plusieurs reprises. Cette technique a permis aux chercheurs d’élucider les interactions neurono-glial, les interactions neuro-immunes et la dynamique neurocellocellique de périodes prolongées en santé et en pathologie.
