Les endocannabinoïdes sont des médiateurs lipidiques conservés qui régulent de multiples processus biologiques dans une variété d’organismes. Les premiers endocannabinoïdes découverts sont l’anandamide et le 2-arachidonoylglycerol, 2-AG. Le nématode C.elegans est un modèle animal puissant pour étudier une grande variété de processus biologiques.
Récemment, nous avons découvert que 2-AG joue un rôle fondamental dans la régulation du trafic de cholestérol chez C.elegans. C’est pourquoi il est devenu impératif de concevoir et d’optimiser une méthode d’étude de l’endogène 2-AG par détection et quantification chez C.elegans. Les méthodes d’analyse précédemment signalées pour quantifier 2-AG dans les échantillons biologiques impliquent habituellement l’utilisation de normes déroutées qui sont acquises commercialement sont nécessaires pour les avoir disponibles à l’achat.
Néanmoins, ils sont coûteux, et en raison de la présence de multiples liaisons doubles, sont sensibles à s’oxyder au fil du temps. La version la plus courante des normes est basée sur l’acide arachidonique octadeuterated étant approprié pour la quantification par dilution d’isotope, par chromatographie liquide, et spectroscopie postérieure de masse. Pour surmonter les difficultés liées au coût et à la stabilité des normes de stérilisation pour quantifier 2-AG, nous avons utilisé une méthode pratique et simple pour préparer une norme analytique basée sur le deutérium-5-glycérol.
La séquence de préparation de la norme pénétérite nécessite une procédure en trois étapes. Être possible d’être conservé sous la forme protégée jusqu’à ce qu’il soit nécessaire. L’objectif principal de ces travaux est de montrer une méthode complète pour étudier 2-AG dans C.elegans de la synthèse de la norme analytique stérilisée à la préparation et l’extraction des échantillons de nématodes et enfin, l’analyse par chromatographie liquide et spectroscopie de masse.
Pour obtenir 1-AG stérilisé comme norme interne de stérilisation pour des analyses de quantification suivent un protocole en trois étapes. Afin de ne protéger que les alcools primaires, ajoutez d’abord 38 milligrammes de glycérol stérilisé à un tube de réaction de 10 millilitres à l’aide d’une pipette Pasteur et ajoutez un agitateur magnétique. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de DCM anhydre à l’aide d’une seringue Hamilton de cinq millilitres et remplissez le tube d’azote sec pour donner une atmosphère inerte.
Préparer un bain à l’aide d’un flacon peu profond de Dewar rempli d’acétate d’éthyle distillé. Remplissez le tube de réaction hermétiquement fermé à l’intérieur du bain et refroidissez-le en ajoutant lentement l’azote liquide à l’acétate d’éthyle jusqu’à ce que le solvant soit congelé. Attention, le liquide bout violemment à température ambiante et peut causer de graves brûlures en cas de contact avec les yeux et la peau.
Ensuite, ajouter 54 milligrammes de collidine anhydre à l’aide d’une seringue Hamilton. Attention, la collidine est volatile et a une odeur très forte et désagréable. À 70 milligrammes de terbutile-diméthyl-céylchlorure et remuer le tout pendant trois heures à moins 78 degrés sur un agitateur magnétique.
Ajouter deux millilitres de saumure pour étancher la réaction. Extraire la solution avec deux millilitres de dichloromethane distillé trois fois à l’aide d’un entonnoir séparé gardant les extraits organiques à chaque fois. Ensuite, mélanger les trois extraits organiques et sécher sur de la sulfite de sodium.
Purifier le mélange brut par chromatographie de colonne en utilisant le gel de silice comme phase stationnaire et un gradient d’acétate d’hexane éthylique augmentant de 100% à partir de 100% d’hexane et se terminant avec de l’acétate 100% éthylique. Pour cette étape d’estérification, ajouter 10 milligrammes du produit précédemment indiqué à un tube de réaction de 10 millilitres à l’aide d’une pippette Pasteur et ajouter un agitateur magnétique. Ajouter deux millilitres de DCM anhydre à l’aide d’une seringue Hamilton de cinq millilitres et remplir le tube d’azote sec pour donner une atmosphère inerte.
Refroidir la solution à zéro degré à l’aide d’un bain de glace. Annonce 36 milligrammes d’acide arachidonique à l’aide d’une micropipette réglable à plusieurs volumes et remuer. Ajouter ensuite 15 milligrammes de 40-méthyl-aminopyridine et remuer.
Ajouter 15 milligrammes de diacylpropylcarbodiimid à l’aide d’une micropipette réglable à plusieurs volumes et remuer. Ajouter deux millilitres d’eau pour étancher la réaction, puis extraire la solution avec deux millilitres de DCM distillé trois fois à l’aide d’un entonnoir séparateur. Combinez les trois extraits organiques et séchez sur la sulfite de sodium, purifiez le mélange brut par chromatographie de colonne utilisant le gel de silice comme phase stationnaire un gradient d’acétate d’éthyle puis 10% croissant à partir de 100% d’hexane et terminant avec 50 50% d’acétate d’éthyle hexane.
Enfin, pour l’étape de dépprotection, ajouter 15 milligrammes du produit précédemment synthétisé à un tube de réaction de 10 millilitres à l’aide d’une pipette Pasteur et ajouter un agitateur magnétique. Ajouter deux millilitres de tétrahydrofuran anhydre à l’aide d’une seringue Hamilton de cinq millilitres et remplir le tube d’azote sec pour donner une atmosphère inerte. Ensuite, refroidir la solution à zéro degré à l’aide d’un bain de glace.
Ajouter 150 microlitres drop-wise d’une solution molaire de fluorure de tétrabutylammonium dans THF à l’aide d’une seringue Hamilton. Après une heure, ajouter deux millilitres d’eau pour étancher la réaction. Extraire la solution avec deux millilitres distillés DCM trois fois à l’aide d’un entonnoir séparateur.
Mélanger les trois extraits organiques et sécher sur de la sulfite de sodium. Pour la procédure de blanchiment, retourner les vers sur des plaques NGM ensemencées de six centimètres. Laissez le ver pousser de deux à trois jours afin qu’il y ait beaucoup d’œufs et d’adultes gravid dans l’assiette.
Une fois que vous avez beaucoup d’œufs et d’adultes, versez cinq millilitres de M9 sur l’assiette. À l’aide d’une pipette en verre, transférer les vers dans un tube de faucon de 15 millilitres. Centrifuger le tube pendant deux minutes à 2000 G et pelleter les vers.
Aspiration la plupart de la M9 sans déranger la pastille de ver. Ajoutez trois millilitres de solution de blanchiment et mélangez doucement la solution en inversant pendant environ cinq minutes ou jusqu’à ce que vous voyiez une diminution du nombre de vers adultes intacts. Une fois que la plupart des corps se sont dissous, centrifugeuse à 2000 G pendant une minute.
Aspiration la plupart de la solution de blanchiment sans déranger la pastille de ver. Ajouter 15 millilitres de M9 au tube et bien mélanger. Centrifugeuse à nouveau à 2000 G pendant une minute.
Aspiration la plupart de la M9 sans déranger la pastille de ver. Pour la préparation de l’échantillon de ver, laissez les embryons N2 obtenus par procédure de blanchiment avait dans la nuit dans M9 tampon à 20 degrés. Puis, récolte synchronisée L1s en centrifugant le tube deux minutes à 2000 G.Laver les vers avec M9 tampon une fois de plus et quantifier le nombre de L1 vivant. Ensemencer environ 10 000 vers dans les plaques NGM avec un millilitre d’OP 50 Escherichia coli préalablement séché.
Incuber les plaques au moins pendant 48 heures à 20 degrés jusqu’à ce que les vers atteignent le stade L4. Récoltez les vers à l’aide d’un tampon M9 froid dans un tube de faucon de 50 millilitres. Lavez-les une fois de plus et transférez-les dans un tube de 1,5 millilitres.
Pelleter les vers par centrifugation à 2000 G pendant une minute. Éliminez la plupart des supernatants. Ensuite, plonger le tube dans de l’azote liquide et remuer à moins 80 degrés.
Décongeler environ 100 microlitres de granulés de vers congelés appartenant à N2, puis ajouter 1,3 millilitres de méthanol. Après cela, sonicate l’échantillon pendant quatre minutes. Après la sonication, ajouter 1000 ppb de la norme désotériorée interne, 2,6 millilitres de chloroforme, et 1,3 millilitres de 0,5 molaire de chlorure de potassium, 0,08 molaire d’acide phosphorique à un rapport final de un à un.
Vortex les échantillons pendant une minute, puis sonicate dans un bain d’eau ultrasonique pendant 15 minutes sur la glace. Vortex les échantillons à nouveau deux fois pendant une minute et les centrifuger pendant 10 minutes à 2000 G pour induire la séparation de phase. Recueillir la phase inférieure dans un tube de verre propre, le sécher sous azote, et le resuspendre en 100 microlitres d’acétyltrile.
Pour parvenir à une quantification réussie de l’endogène 2-AG, il était nécessaire de synthétiser son analogique saturé en utilisant une méthode en trois étapes. Par la suite, il a été ajouté à des échantillons de vers, extraits et analysés par chromatographie liquide haute performance, couplée à la spectrométrie de masse. Utilisé comme norme interne, le synthétique stérilisé 1-AG était l’outil pour quantifier le métabolite endogène.
La méthode a été optimisée en utilisant les transitions pour 2-AG et pour 1-AG stérilisé où les molécules de glycérol sont perdues. 2-AG endogène des échantillons de C.elegans a été détecté avec succès et quantifié par dilution isotopique avec le 1-AG stérilisé chimiquement synthétisé utilisant la chromatographie liquide de haute performance couplée à la spectrométrie de masse. L’échantillon un a été préparé avec la norme 1-AG désutérée, tandis que l’échantillon deux sans la norme.
Étant donné que la concentration initiale de la norme déutée dans l’échantillon un et trois était de 1 000 ppb chacun, à partir du rapport de zone maximale, il est possible de calculer la concentration endogène de 2-AG dans l’échantillon de 340 ppb pour l’échantillon un et de 360 ppb pour l’échantillon trois, ce qui donne une moyenne de 350 ppb. Les ratios ont été calculés comme une qualité entre les zones de pointe de 2-AG et de 1-AG stérilisé, respectivement, pour deux échantillons isolés. Les deux avec la norme stérilisé ajouté avant l’extraction.
Compte tenu de l’importance récemment découverte de 2-AG dans l’amélioration du trafic de cholestérol et le manque d’information sur la façon dont les lipides influencent ce processus, il était nécessaire une méthode de détection fiable pour cet endocannabinoïde. Le développement réussi d’une méthode synthétique simple et robuste rapportée ici pour obtenir l’analogique stérilisé 2-AG était une étape clé de ce protocole. La plupart des méthodes signalées pour quantifier les monoacylglycérols impliquent l’utilisation de normes analytiques disponibles dans le commerce, qui sont généralement coûteuses et instables dans des conditions de stockage régulières, ce qui en fait un inaccessible pour les laboratoires à petit budget.
Toutefois, cette méthode résout ce problème en proposant une synthèse de la norme à l’aide de matériaux de départ plus accessibles. La méthode synthétique est simple sans conditions sophistiquées nécessaires, ce qui le rend idéal pour être effectué dans n’importe quel laboratoire avec un équipement minimal et l’accès aux ré reactants, même dans un budget réduit. En résumé, cette nouvelle procédure décrit une façon simple et reproductible de détecter et de quantifier 2-AG qui aidera à répondre à certaines des questions soulevées après la description du rôle de ces endocannabinoïdes dans le trafic de cholestérol chez C.elegans.
