Nous décrivons ici un simple flux de travail basé sur opensource fidjien nommé Worm-align, qui peut être utilisé pour générer des montages simples ou multicanaux de vers redressés d’intérêt à partir d’images de microscopie brutes. Étant donné que ce flux de travail repose sur des animaux d’intérêt sélectionnés par l’utilisateur, il peut être particulièrement utile lors de l’analyse d’images de C.elegans où les vers ne sont pas tous au bon stade ou à la bonne condition. Il convient de noter que la sortie de Worm-align peut être utilisée pour la quantification ultérieure de la fluorescence avec les Fidji ou d’autres logiciels d’analyse d’image.
Ici, nous démontrons la quantification par fluorescence à l’aide du pipeline CellProfiler Worm_CP. Commencez par créer une micropipette buccae en étendant un mince capillaire en verre dans la flamme d’un brûleur Bunsen. Après extension dans la flamme, casser le capillaire en deux morceaux s’il ne s’est pas cassé en deux morceaux après extension.
S’il s’est brisé en deux morceaux, coupez l’extrémité de la plus longue. Sélectionnez la pièce plus longue et testez si le capillaire est ouvert en essayant d’aspirer l’eau. Détachez l’adaptateur d’un tube en silicone de trois millimètres.
Branchez le capillaire en verre dans un adaptateur capillaire relié à un tube en silicone de six millimètres. Branchez ensuite l’autre extrémité du tube de six millimètres dans un filtre de 0,2 micromètre et un tube de silicone de trois millimètres à son autre extrémité. Branchez une pointe de filtre d’un millimètre dans l’extrémité libre du tube de silicone de trois millimètres pour aspirer le liquide.
Sous un microscope à dissection, enlever autant de liquide que possible autour d’une pastille de vers fixes avec la micropipette buccae. Ajouter rapidement 10 microlitres de milieu de montage au fond du tube. Rincer une pointe de 10 microlitres dans PBS avec des traces de détergent pour empêcher les vers de coller sur les côtés de la pointe de pipette en plastique.
Ensuite, coupez l’extrémité de la pointe avec une paire de ciseaux. Transférer huit microlitres de milieu de montage avec les vers sur un tampon d’agarose préparé précédemment. Tout en observant la lame sous le microscope, agitez-la doucement pour éviter le chevauchement des vers.
Couvrez ensuite la goutte de milieu de montage sur la garniture d’agarose avec un coverslip de 18 par 18 millimètres. Pour monter des vers vivants, pipette trois à quatre microlitres de trois levamisole millimolaire dissous en M9 sur un tampon agarose. Choisissez 30 à 50 vers par condition dans la goutte de levamisole.
Couvrez ensuite la goutte d’un coverslip de 18 par 18 millimètres et imagez les vers en moins d’une heure. Installez le logiciel d’analyse d’images open source Fidji à partir d’ImageJ, ou s’il est déjà installé sur l’ordinateur, vérifiez qu’il s’agit de la version 1.52A ou plus tard, puis téléchargez le référentiel Worm-align de GitHub et enregistrez-le sur l’ordinateur. Une fois que tous les composants du pipeline ont été téléchargés et installés, ouvrez Fidji et exécutez la macro Worm-align en cliquant sur plugins, macros, et exécuter dans la barre de menu principal.
Localisez l’alignement des vers. script ijm et cliquez sur ouvrir. Accédez au dossier d’entrée avec les images à analyser et cliquez sur sélectionnez, en vous assurant que le dossier sélectionné ne contient que des fichiers d’image.
La macro générera automatiquement un dossier de sortie où tous les résultats seront enregistrés. Le nom du dossier sera le même que le dossier d’entrée avec sortie comme post-correctif. Permettez à la macro d’ouvrir la première image dans le dossier d’entrée et de l’utiliser comme une image représentative pour extraire les paramètres nécessaires pour générer le montage, y compris la largeur des vers, la luminosité et le contraste.
À l’aide de l’outil de dessin en ligne droite, tracez une ligne sur toute la largeur d’un ver et cliquez sur OK. Utilisez la longueur de cette ligne pour déterminer la hauteur des régions cultivées pour les vers simples. Pour chaque canal, spécifiez le nom, la table de recherche et s’il doit être inclus dans le montage, puis cliquez sur OK. Ensuite, ajustez les paramètres de luminosité et de contraste pour les canaux à l’aide des curseurs. Répétez ce processus pour les canaux restants.
Une fois que tous les paramètres ont été configurés, ils seront enregistrés dans une table de paramètres et enregistrés sur le sous-fichier CellProfiler du dossier de sortie. Une image est générée pour montrer à quoi ressembleront toutes les images après l’application des paramètres. Si l’image est satisfaisante, cochez la case supérieure.
La deuxième et la troisième case du panneau de coché tous les paramètres spécifient les options pour la génération de montage. Laissez les deux cases cochées et cliquez sur OK pour exécuter le reste de la macro. Si vous ne cochez pas la case supérieure, la macro sera réexécuter la configuration.
La macro procède ensuite à l’ouverture de toutes les images dans le dossier d’entrée. Pour chaque image, tracez des lignes sur l’axe longitudinal de tous les vers à inclure dans le montage en utilisant l’outil segmenté ou la ligne à main levée. Tracez les lignes uniformément de la tête à la queue ou vice versa le long de toute la longueur des vers et ajoutez chaque ligne au gestionnaire de roi en cliquant sur Contrôle T.Once tous les vers désirés ont été ajoutés, cliquez SUR OK. L’alignement des vers générera alors des images recadrées de vers sélectionnés, qui seront enregistrés dans le sous-fichier de ver unique du dossier de sortie.
Les montages de tous les vers sélectionnés seront enregistrés dans le dossier aligné. Téléchargez et installez CellProfiler 2.2.0 en cliquant sur le lien pour les versions précédentes de CellProfiler sur la page de téléchargement et en sélectionnant le système d’exploitation requis. Avant de commencer le pipeline Worm_CP, assurez-vous que toutes les images de sortie attendues sont présentes dans le sous-foldeur CellProfiler du dossier de sortie Worm-align.
Une copie traitée de l’image originale, un masque d’image binaire de la population de vers, un masque d’alignement si la ligne est tracée sur des vers sélectionnés et une image représentant chacun des canaux de l’image originale doivent être présents. Ouvrez CellProfiler, puis cliquez sur le module d’entrée d’images et faites glisser le dossier du module CellProfiler dans la fenêtre qui indique déposer des fichiers et des dossiers ici. Si une liste d’images est présente à partir d’une analyse précédente, supprimez-les d’abord en cliquant à droite dans la fenêtre et en sélectionnant la liste de fichiers claire.
Cliquez sur le module d’entrée des métadonnées et sur la deuxième méthode d’extraction, cliquez sur le dossier jaune et naviguez vers le sous-fichier CellProfiler du dossier de sortie Worm-align. Sélectionnez le fichier paramètres, puis cliquez sur mise à jour. Ensuite, cliquez sur le module d’entrée noms et types, et assurez-vous que toutes les images requises pour le pipeline sont présentes.
Avant d’exécuter le pipeline, sélectionnez une destination pour les résultats de sortie dans le module de sortie. Utilisez le mode de test pour voir comment le pipeline fonctionne en cliquant sur le mode de test de démarrage et lui permettre de courir à travers la première image dans le dossier. Lorsque vous êtes satisfait des performances du pipeline, cliquez sur le mode de test de sortie et analysez les images.
Avant de commencer l’analyse, assurez-vous que tous les yeux devant le module d’analyse sont fermés. Lorsque l’analyse est terminée, Worm_CP dossier de sortie qui se compose de deux fichiers CSV, vers CSV et lignes CSV. La culture et l’imagerie de C.elegans selon la méthode décrite dans ce protocole produisent de grandes images d’aperçu des populations de vers.
La sortie du pipeline dépend en grande partie de la qualité des lignes tracées au-dessus des images. Plusieurs exemples de lignes et leur sortie de Worm-align sont affichés ici. Lors de l’utilisation du script Worm-align, l’identification visuelle des vers qui se croisent est possible à partir des images de superposition trouvées dans le sous-foldeur de données, ainsi que des panneaux de vers individuels dans le montage.
Le tableau QC peut également être utilisé pour identifier les vers qui se chevauchent. Toutefois, les lignes qui se croisent sont problématiques pour Worm_CP pipeline. C’est parce Worm_CP utilise masque de ligne, pas des régions d’intérêt, pour aider à identifier les vers individuels.
Par conséquent, CellProfiler segmente l’un des vers comme deux objets. Le pipeline Worm_CP a été utilisé pour quantifier l’intensité de fluorescence des animaux fixes étiquetés avec un colorant fluorescent qui s’incorpore dans les gouttelettes lipidiques. La teneur en gouttelettes lipidiques est diminuée de 17 % entre les animaux sauvages et mutants DBL1 à l’aide d’une quantification manuelle, et de 12 % à l’aide Worm_CP pipeline.
Worm_CP a également été utilisé pour quantifier la réponse aux chocs thermiques chez les vers vivants exprimant gfp sous contrôle d’un gène inductible de choc thermique. En l’absence de stress thermique, les vers n’ont pas induit l’expression GFP. Lorsque les vers sont exposés comme un choc thermique court, l’expression GFP est induite.
La sortie de Worm_CP dépend en grande partie de la qualité des lignes que vous dessinez à l’aide de Worm-align. Assurez-vous que vos lignes ne se touchent pas ou ne se chevauchent pas et dessinez toutes vos lignes dans la même direction. La vérification de la table QC peut vous aider à identifier les lignes qui se touchent ou se chevauchent afin que vous puissiez exclure ces cas de votre analyse.
La sortie de Worm-align peut être utilisée pour la quantification ultérieure soit aux Fidji, soit dans d’autres logiciels d’analyse d’images. Nous avons montré ici un pipeline CellProfiler très basique dans lequel d’autres modules d’analyse pourraient très facilement être incorporés, par exemple, pour compter le nombre de gouttelettes lipidiques ou quantifier l’intensité des gouttelettes individuelles dans un ver. Un des avantages de cette technique est la possibilité de quantifier rapidement la fluorescence des vers individuels.
Dans notre laboratoire, nous nous intéressons à la viabilité individuelle à l’aide de journalistes de fluorescence et nous utilisons worm-align et Worm_CP régulièrement à cette fin.
