Une compréhension complète du rôle que jouent les cellules M dans l’homéostasie intestinale et la défense immunitaire fait défaut, en raison de la rareté des cellules M dans l’intestin. La différenciation induite des cellules M dans les cultures dérivées des cellules souches intestinales humaines permettra d’étudier le développement et les fonctions des cellules M. Pour enduire les membranes Transwell, placez le nombre désiré de Transwells dans une plaque de puits de 24, créant ainsi un système à deux chambres.
Diluer la matrice extracellulaire, ou ECM, 25 fois en saline tamponnée de phosphate stérile froid. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution diluée à froid dans chaque chambre supérieure sur la membrane. Couvrir la plaque de puits 24 avec un couvercle, et placer la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant deux heures pour permettre la solidification ECM sur la membrane.
Après deux heures, retirer la plaque de l’incubateur et la placer dans une hotte de culture tissulaire. À l’aide d’une pince stérile, inverser chaque Transwell pour enlever délicatement le reste de la solution. Laissez les membranes sécher à l’air libre dans le capot avec le couvercle ouvert pendant que les cellules sont collectées.
Retirez la plaque d’entéroïdes iléaux de l’incubateur et retirez doucement les supports de culture de chaque puits par aspiration sous vide ou avec une pipette. Pour briser l’ECM, ajouter 500 microlitres de glace froide 0,5 millimolar EDTA à chaque puits contenant des entéroïdes iléaux suspendus dans ECM. Pipette de haut en bas vigoureusement avec un pipetter P1000 réglé à 500 microlitres pour briser ECM, libérant ainsi des entéroïdes iléaux dans la solution.
Recueillir la solution de chaque puits en tubes coniques de 15 millilitres. Pelleter les cellules dans une centrifugeuse à 140G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Pellet doit être visible, mais peut être facilement délogé, afin d’enlever lentement le supernatant par aspiration sous vide ou avec une pipette.
Pour digérer les liens étroits de jonction et décomposer les entéroïdes iléaux en cellules individuelles, résuspendez la pastille dans 500 microlitres de trypsine à température ambiante pour chaque cinq puits collectés. À l’aide d’un pipetter P1000, pipette de haut en bas pour désaggréger les touffes. Incuber les tubes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant cinq minutes ou moins.
Ajouter un millilitre de DMEM F-12 avancé avec 10% FPS par 500 microlitres de trypsine pour inactiver la trypsine. Pipette de haut en bas avec un P1000 réglé à 500 microlitres au moins 50 fois contre le côté du tube conique pour diaboler davantage les touffes restantes en cellules individuelles. Placez une passoire cellulaire de 40 microns sur un tube conique de 50 millilitres et ajoutez un millilitre de DMEM F-12 avancé avec 10 % de FPS pour mouiller la passoire cellulaire.
Pipette la suspension à cellule unique du cône de 15 millilitres sur la passoire. Lavez la passoire avec un millilitre de DMEM F-12 avancé avec 10% FPS. Transférer les cellules qui ont traversé la passoire cellulaire à partir du tube conique de 50 millilitres dans un nouveau tube conique de 15 millilitres.
Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifuger les cellules dans le nouveau tube de 15 millilitres à 400G pendant cinq minutes à température ambiante. La pastille cellulaire doit être visible.
Retirez soigneusement le supernatant à l’aide d’une pipette, en sauvant à nouveau le surnatant au cas où la pastille se délogerait. Resuspendez la pastille cellulaire dans MCMGF plus avec 10 micromolar Y27632. Assurez-vous que les membranes codées ecm ont complètement séché comme évalué par l’œil.
Lavez la chambre haute avec 200 microlitres de MCMGF plus. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de solution cellulaire dans chaque chambre haute. Ajouter 700 microlitres de MCMGF plus avec 10 micromolaires Y27632 à chaque chambre basse.
Placez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire de 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2. Après une journée de croissance, retirez les médias de la chambre haute et remplacez-les par 200 microlitres de MCMGF frais plus pour empêcher la croissance de plusieurs couches cellulaires. Une fois que les monocouches sont environ 80% confluent, généralement entre les jours un à trois après l’ensemencement, remplacer les médias basilateral par des supports de différenciation pour les puits de contrôle, ou avec des médias cellulaires M pour les puits d’induction cellulaire M.
Remplacez les médias à la Chambre haute par des supports de différenciation pour les deux conditions. Pour vérifier la différenciation des cellules M par QRTPCR, retirez d’abord les supports des chambres supérieures et inférieures. Lavez doucement la chambre haute deux fois avec 300 microlitres de PPS à température ambiante.
Ajouter 300 microlitres de TRIzol à chaque chambre haute et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Pendant ce temps, étiquetez les tubes de micro centrifugeuse pour chaque puits, et ajoutez 700 microlitres de TRIzol à chaque tube. Recueillir l’homogénéité cellulaire en pipetting doucement de haut en bas trois fois avec un P1000, et transférer le contenu dans les tubes de micro centrifugeuse correspondantes.
Vortex pendant cinq secondes pour mélanger. Gardez les échantillons à température ambiante pendant trois minutes supplémentaires, puis continuez avec les protocoles QRTPCR standard, ou stockez les échantillons à 80 degrés Celsius négatifs. Pour vérifier la différenciation des cellules M par immunofluorescence, d’abord, retirez les médias de la chambre haute.
Laver délicatement deux fois avec 300 microlitres de PBS à température ambiante. Ajouter 100 microlitres de température ambiante 4%PFA en PBS à la chambre haute. Couvrir la plaque de papier d’aluminium et laisser reposer 25 minutes à température ambiante.
Après avoir enlevé le PFA, laver la chambre haute trois fois avec 300 microlitres de température ambiante PBS. Incuber les monocouches avec 100 microlitres de 5%BSA dissous dans PBS pendant 30 minutes dans l’obscurité à température ambiante pour bloquer les monocouches avant d’enlever la solution. Préparez la solution primaire d’anticorps GP2 dans un pour cent de BSA dans PBS à une dilution de un à 100, et ajoutez 100 microlitres par puits.
Tacher pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité, avant d’enlever la solution. Lavez la chambre haute trois fois avec 300 microlitres de température ambiante PBS. Préparez une solution de tache secondaire de chèvre étiquetée fluorescente anti-souris IgG phalloidin et DAPI, et ajouter 100 microlitres par puits.
Tacher pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Lavez les puits trois fois avec 300 microlitres de PBS. Ensuite, placez une goutte de cinq microlitres de solution de montage sur une glissière en verre.
Retirer le puits de la plaque de 24 puits et inverser. Lors de l’enlèvement de la membrane du Transwell, la membrane doit rester complètement plate. Bosses dans la membrane empêcher un joint ferme à la glissière de verre, et peut grandement affecter la qualité de l’image.
Pour assurer le succès, couper soigneusement la membrane du puits à l’aide d’un scalpel pointu. Placez la membrane avec les cellules orientées vers le haut sur la gouttelette de la solution de montage sur la glissière en verre. Ajouter 10 microlitres de solution de montage sur le dessus et le centre de la membrane, et placer un glissement de couvercle sur le dessus pour sceller la membrane entre la glissière de verre et le glissement de couverture.
Séchez les glissières à température ambiante dans l’obscurité pendant 24 heures. Les cellules M sont détectées par l’expression de surface du GP2 par des immunofluorescents. Typiquement, dans un monocouche confluent, une à cinq cellules de M sont observées dans un champ donné de microscope au grossissement de 40X par jours six à huit après ensemencement dans les échantillons traités avec RANKL et Alpha de TNF.
Aucune expression GP2 n’est observée dans les échantillons non traités. La vue orthogonale du plan XZ superposée à une sonde de phalloidine montre des structures d’actine entourant chaque cellule, et l’expression GP2 sur la surface apical des cellules M. Ce modèle récapitule la faible fréquence des cellules M trouvées dans l’intestin humain.
Pour déterminer si les cellules M développées dans ce modèle sont capables de se lier à IgA, la présence d’IgA sur les cellules M est visualisée à l’aide d’un anticorps secondaire conjugué au fluor qui reconnaît la chaîne lourde du sérum humain IgA. Les cellules M traitées avec IgA pendant une heure ont IgA lié à la surface apical, tandis que les cellules M dans les puits de contrôle qui ont été seulement traités avec l’anticorps secondaire à IgA, n’ont aucun signal détectable. En outre, IgA se lie spécifiquement à la surface apical des cellules M, et n’est pas trouvé lié à des cellules dépourvues de tache de surface GP2.
En outre, les cellules M ont typiquement plus courte actine dense sur leur surface apical. Passer à RANKL TNF alpha complété les médias de différenciation lorsque les monocouches sont environ 80%confluent, est la clé pour atteindre une bonne différenciation des cellules M. Cette technique permettra aux chercheurs d’explorer les questions liées au développement des cellules M, ainsi que les interactions avec les pathogènes hôtes et les études sur le transport de médicaments impliquant les cellules M.
