Les entéroïdes sont des organoïdes tridimensionnels dérivés de cellules épithéliales intestinales. Ils sont idéaux pour l’étude des interactions physiologiques complexes, de la signalisation cellulaire, et de la défense d’agent pathogène d’hôte. Notre protocole décrit comment cultiver les entéroïdes humains après isoler les cellules souches intestinales des patients subissant la résection intestinale.
La co-administration du lipopolysaccharide dans nos médias de culture cause une réponse inflammatoire dans les enteroids menant aux changements histologiques, génétiques, et d’expression de protéine semblables à ceux vus dans l’entérocolite nécrosante humaine. Étant donné que l’étude de l’entérocolite nécrosante et des agents thérapeutiques potentiels est éthiquement difficile chez les sujets humains, en particulier chez les enfants, il est hautement souhaitable d’utiliser ce nouveau modèle entéroïde biologiquement pertinent de l’entérocolite nécrosante utilisant le tissu néonatal humain. Le principal avantage de cette technique est que les entéroïdes sont capables de récapituler les multiples types de cellules de l’épithélium intestinal humain et sont capables de surmonter les limitations reconnues des modèles animaux et des systèmes cellulaires.
Christie Buonpane, résidente en chirurgie, et Carrie Yuan, technicienne de laboratoire de notre laboratoire, contribueront à démontrer l’intervention. Au moment de la collecte dans la suite opératoire, placez le petit échantillon de tissu intestinal humain dans le DPBS froid. Lavez le spécimen dans le DPBS froid jusqu’à ce qu’il soit dégagé du sang et des selles.
Conservez le spécimen dans le milieu RPMI 1640 à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’isolement de la crypte. Lorsque vous êtes prêt à procéder, vérifiez à nouveau que le spécimen est dégagé des selles et du sang. À l’aide de ciseaux dissecting délicats enlever tout excès de graisse ou de clips chirurgicaux et agrafes.
Weight le spécimen et viser une pièce qui est d’environ 0,75 à 2,5 grammes. Ensuite, coupez le tissu en morceaux de 0,5 centimètre et placez-les dans un tube contenant 30 millilitres de tampon numéro un. Agiter à basse vitesse pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.
Filtrez ensuite le tissu à travers une passoire cellulaire de 100 micromètres et jetez le flux à travers. Ajouter le tissu filtré à un tube contenant 30 millilitres de tampon numéro deux. Agiter à basse vitesse pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.
Filtrer le tissu à travers un filtre de 100 micromètres et jeter le flux à travers. Après cela, décongeler 500 microlitres de matrice membranaire du sous-sol sur la glace pour une utilisation ultérieure. Ajouter un peu de tissu à 10 millilitres de DMEM froid dans un tube conique de 50 millilitres et agiter vigoureusement à la main pendant 10 secondes.
Filtrer cette suspension à travers une passoire à cellules de 100 micromètres et recueillir le flux à travers. Gardez ce tube sur la glace. Ajouter un peu de tissu à un autre 10 millilitres de DMEM froid dans un tube conique séparé de 50 millilitres et agiter vigoureusement à la main pendant 10 secondes.
Filtrer cette suspension à travers une passoire à cellules de 100 micromètres et recueillir le flux à travers. Répétez le processus deux fois de plus jusqu’à ce qu’il y ait quatre tubes coniques contenant le flux à travers étiqueté un à quatre. Ensuite, filtrer la solution dans le tube numéro un à travers une passoire à cellules de 100 micromètres et transférer le flux à travers dans un tube conique de 15 millilitres également étiqueté numéro un.
Répétez ce processus pour les tubes deux à quatre. Centrifugeuse les tubes de 15 millilitres à 200 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Dans le capot d’écoulement laminaire, retirez le supernatant de chaque tube et jetez-le.
Évitez de perturber le nuage de tissu immédiatement au-dessus de la pastille, même si cela signifie laisser un peu de surnatant derrière. Dans chaque tube, pipette de haut en bas lentement pour mélanger la pastille avec les restes supernatants. Transférer le mélange de chaque tube dans un seul tube conique de deux millilitres et centrifugeuse à 200 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.
Après cela, retirez le supernatant et réutilisez la pastille dans 500 microlitres de matrice membranaire prégelée du sous-sol. Utilisez une pointe de pipette réfrigérée pour appliquer 50 microlitres de cette suspension au centre d’un puits dans une plaque de 24 puits. Cet échantillon doit apparaître en forme de dôme.
Répétez ce processus de demande neuf fois pour remplir 10 puits totaux. Transférer la plaque de puits 24 dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 % à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour permettre la polymérisation. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de miniguts humains complets à chaque puits.
Continuez à couver dans les mêmes conditions, en vous assurant de remplacer ce média tous les deux jours. Tout d’abord, ajouter 10 microlitres de LPS à une concentration de cinq milligrammes par millilitre aux 500 microlitres de miniguts humains complets dans chaque puits de la plaque le jour zéro. Continuer à couver à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et remplacer les médias supplémentaires tous les deux jours jusqu’à la collecte.
Pour se préparer à l’intégration de la paraffine, retirez d’abord doucement le média, ajoutez un millilitre de PBS, et pipette doucement de haut en bas pour dissoudre la matrice membranaire du sous-sol tout en prenant soin de ne pas lyse les entéroïdes. Centrifugeuse à une vitesse inférieure à 300 fois G pendant cinq minutes pour pelleter, puis enlever le PBS. Ajouter 4% de paraformaldéhyde et réserver le tube pendant une heure pour fixer à température ambiante.
Centrifugeuse à une vitesse inférieure à 300 fois G pendant cinq minutes à pelleter, puis enlever le paraformaldéhyde. Laver délicatement avec un millilitre de PBS et une centrifugeuse à une vitesse inférieure à 300 fois G pendant cinq minutes. Retirez ensuite le PBS.
Répétez ce processus de lavage avec PBS une fois. Placer la quantité désirée du gel de traitement des tissus dans un tube conique et le réchauffer dans un incubateur de bain sec à 65 degrés Celsius pendant trois à 10 minutes jusqu’à ce qu’il soit liquide. Après cela, ajouter le gel fondu de traitement des tissus à la pastille et mélanger délicatement.
Placer un petit anneau de clonage dans un coverslip. Pipette le gel de traitement des tissus et le mélange enteroid dans l’anneau de clonage qui est monté sur un coverslip. Laissez le gel de traitement tissulaire et le mélange enentéroïde se solidifier à quatre degrés Celsius pendant une heure.
Ensuite, submergez l’anneau de clonage avec le mélange solidifié en 70% d’éthanol pour se préparer à l’intégration de la paraffine. Immédiatement après le placage, les cryptes intestinales fraîchement isolantes apparaissent sous forme de tiges allongées. En quelques heures, les enteroids prennent une apparence ronde.
Au cours des prochains jours, les entéroïdes commenceront à former des sphères. Le bourgeonnement devrait se produire entre cinq et 10 jours, c’est-à-dire lorsque la collecte enteroid devrait se produire. Les entéroïdes en croissance présentent également une polarité, contenant un lumen centralisé, une bordure apical, et un domaine basilateral.
Les entéroïdes montrent également l’intégrité structurale représentée par un cytosquelette d’actine robuste. Après plusieurs jours en culture, les enteroïdes traités par LBS éprouvent plus d’apoptose et ont un rendement inférieur à celui du groupe témoin. Comme on le voit chez l’homme NEC dans les modèles murins de NEC, une expression accrue du péage comme le récepteur quatre se trouve dans les enteroids traités par LPS par rapport aux contrôles.
Les entéroïdes peuvent également être recueillis pour l’extraction de l’ARN et des protéines à l’aide de qRT-PCR bien établis et les techniques occidentales de ballonnement l’expression des gènes et l’isolement des protéines peuvent être effectuées.
