Le protocole facilite la dissection du muscle de vol indirect étiqueté GFP de Drosophila à divers moments pendant le développement de pupes pour évaluer des changements dans l’expression de gène et de protéine. En utilisant ces techniques, un échantillon élevé enrichi de muscle de vol avec la dégradation minimale de protéine d’ARN peut être réalisé qui convient à RT-PCR, tache occidentale, ou approches omiques. Ces dissections spécialisées nécessitent de la pratique et des compétences, mais le nombre de pupes qui peuvent être disséquées et la qualité des échantillons s’améliorent avec l’expérience.
La démonstration visuelle de cette dissection est essentielle pour déterminer comment distinguer les muscles de vol des tissus non musculaires et faciliter l’isolement rapide des muscles de vol des spécimens pupals. Pour mettre en scène les pupes, utilisez un pinceau mouillé pour recueillir et transférer les préppes dans une boîte de Pétri de 60 millimètres, et faire le sexe des nymphes au microscope binoculaire. Les mâles sont identifiés par la présence de testicules, qui apparaissent comme des globes translucides sur les pupes par ailleurs opaques.
Après avoir étiqueté le plat avec l’heure, la date et le génotype des mouches, vieillir les pupes dans un incubateur de 25 à 27 degrés Celsius jusqu’au stade approprié. Pour la dissection IFM avant 48 H APF, utilisez un pinceau mouillé pour transférer les nymphes correctement mises en scène dans un plat de dissection noir d’environ 2/3 rempli de PBS réfrigéré. Sous le microscope à disséquer fluorescent, utilisez un 5 forceps pour pousser l’une des nymphes au fond du plat de dissection noir.
Ajustez le zoom et concentrez-vous au microscope jusqu’à ce que les pupes puissent être clairement visualisées. À l’aide d’une paire de forceps pour saisir l’antérieur des pupes, piquer les nymphes avec une seule pointe d’une deuxième paire de forceps, légèrement hors-centre dans l’abdomen, juste derrière le thorax. Utilisez la première paire de forceps pour enlever la moitié antérieure du boîtier pupal, et pour pincer les pupes exposées juste derrière le thorax pour séparer l’abdomen du thorax.
Ensuite, pressez doucement la partie antérieure du thorax pour exposer les MCI étiquetés fluorescents. Ensuite, utilisez les forceps pour jeter la carcasse restante de l’autre côté du plat, et disséquez les nymphes suivantes de la même manière. Lorsque toutes les pupes ont été disséquées, utilisez les forceps pour recueillir les fibres IFM, et d’organiser les fibres en un tas au fond du plat de dissecting noir.
Utilisez les forceps pour pousser les débris hors du champ de vision, et enlever tous les muscles non-IFM, graisse, cuticules, ou d’autres tissus indésirables des échantillons. Ensuite, utilisez une pointe de pipette coupée pour transférer le tas d’IFMs dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant 250 microlitres de PBS réfrigéré. Pour la dissection IFM après 48 H APF, utilisez un pinceau légèrement mouillé pour transférer les pupes mises en scène sur une bande de ruban adhésif à double face montée sur une lame de microscope.
Orientez les pupes dans une ligne, côté ventral vers le bas, et antérieur vers le bas de la glissière. Lorsque toutes les nymphes ont été placées, utilisez des forceps pour taquiner et ouvrir le premier boîtier pupal au-dessus des spiracles antérieurs, et faites glisser doucement une paire de forceps dorsalement, vers le postérieur, coupant le boîtier pupal au fur et à mesure que les forceps se déplacent. Libérez les pupes du boîtier ouvert, et transférez immédiatement les pupes à une goutte de PBS sur une deuxième diapositive de microscope.
Lorsque tous les pupes sont libérés, utilisez de fines ciseaux pour couper l’abdomen des pupes loin du thorax, et pousser les abdomens dans un tas séparé. Lorsque tous les thoraxes ont été enlevés, utilisez un morceau de papier de soie pour enlever la majorité du PBS et le tas d’abdomens. Ajouter une goutte de PBS frais et réfrigéré aux thorax restants, avant d’utiliser les ciseaux pour couper de la tête le long de l’axe longitudinal du corps en un seul mouvement pour diviser le thorax en deux.
Lorsque toutes les nymphes ont été disséquées, utilisez les 5 forceps pour sélectionner l’une des hémisections, et insérez doucement les pointes d’un forceps au-dessus et au-dessous du milieu des MSI. En tenant la première paire de forceps immobiles, utilisez de fines ciseaux pour couper une extrémité de l’IFM loin de la cuticule et des tendons, avant de faire pivoter les pupes à 180 degrés, pour permettre à l’autre extrémité de l’IFM d’être coupée libre de la cuticule et des tendons. Utilisez des forceps pour transférer le faisceau IFM du thorax au bord de la bulle PBS, en utilisant la tension de l’eau pour maintenir le faisceau en place.
Ensuite, poussez la carcasse de l’autre côté de la glissière et disséquez le reste des IFM de la même manière. Lorsque tous les MSI ont été prélevés, utilisez les 5 forceps pour enlever les fragments de muscle ou de cuticule qui pourraient avoir trouvé leur chemin dans les échantillons. Ensuite, utilisez la tension de l’eau pour capturer doucement les MFI disséqués entre une paire de forceps, et placez les IFM dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant 250 microlitres de PBS réfrigérés.
Les données de séquençage de l’ARNm provenant des IFM BRUNO1 IR montrent des changements d’expression au niveau de l’unité génétique par rapport aux données de séquençage des types sauvages. En utilisant la spectrométrie de masse protéome entière sur les MCI disséqués, une régulation similaire est observée aux niveaux des protéines et des isoformes protéiques. Après l’insertion d’une ligne de piège protéique dans l’intron final du Mhc, l’incorporation de la protéine étiquetée GFP peut être observée en IFM sous forme de deux points de chaque côté de la ligne M à 90 H APF, tandis que dans le tissu musculaire des jambes, le signal GFP peut être observé uniformément à travers la ligne M du sarcome.
Lors de l’utilisation de RT-PCR sur l’IFM disséqué, un commutateur isoforme Mhc de l’événement exon 34 à 37 étiqueté GFP à l’événement exon non étiqueté 34 à 35, peut être détecté entre 30 et 48 heures après la formation de puparium à 27 degrés Celsius. À partir des données de séquençage de l’ARNm, les tissus musculaires des jambes et des sauts expriment les trois isoformes du Mhc, maintenant l’expression de l’isoforme étiqueté GFP dans le muscle mature. Le mutant majeur de Spalt et LE BRUNO1 IR-IFM, n’ont pas réussi à désactiver l’expression de l’isoforme de Mhc gfp-étiqueté pendant qu’ils se développent, ayant pour résultat un profil isoforme d’expression ressemblant à celui du tissu de muscle de jambe et de saut.
N’oubliez pas que les dissections doivent être effectuées en moins de 30 minutes pour prévenir la dégradation de l’ARN. Et, pour prendre soin de limiter la contamination par d’autres types de cellules. Cette méthode génère des échantillons enrichis en IFM adaptés aux approches biochimiques comme la RT-PCR, ou ballonnement occidental, ainsi que des approches de style omic, comme la spectrométrie de masse, le séquençage à haut débit, la capture de conformation de la chromatine et la métabolomique.
Ces dissections peuvent compléter les puissantes approches génétiques de Drosophila par des données au niveau des systèmes pour étudier les mécanismes fondamentaux du développement et de la régulation des gènes.
