Ce protocole fournit des méthodes standard et reproductibles pour évaluer les réponses pharmacologiques dans les cultures organoïdes de la prostate. Les cultures organoïdes de la prostate fournissent un système in vitro qui préserve de nombreux aspects de la biologie in vivo et de la réponse pharmacologique en permettant aux cellules d’adopter une structure tridimensionnelle dans une matrice membranaire du sous-sol. Nous sommes particulièrement enthousiastes à l’idée d’utiliser ces méthodes pour évaluer comment le génotype dicte la réponse pharmacologique dans la prostate et pour modéliser la résistance aux médicaments.
Ces méthodes peuvent être appliquées aux systèmes de culture organoïde qui utilisent la méthode de placage dôme. Cependant, les composants dans les médias tels que les facteurs de croissance peuvent différer selon le type de tissu. La démonstration visuelle permettra une discussion plus spécifique et détaillée des étapes du protocole et de leur différe des nombreux autres systèmes de culture organoïde publiés à la disposition des chercheurs.
La culture organoïde prend généralement plus de temps que la culture cellulaire bidimensionnelle. Assurez-vous d’allouer plus de temps à ces méthodes. Commencez par isoler les organoïdes de la prostate de la souris ou des tissus humains.
Hacher et digérer enzymatiquement le tissu pour produire une suspension à cellule unique, puis recueillir les cellules par centrifugation à 300 fois g pendant cinq minutes. Comptez les cellules et réutilisez-les dans la matrice membranaire du sous-sol. Ensuite, plaquez-les à la densité appropriée dans les dômes matriciels sur des plaques de culture organoïdes préchauffées.
Les dômes doivent être à deux millimètres l’un de l’autre et du côté du puits. Une fois solidifié, ajouter doucement les supports du côté du puits pour éviter de perturber la matrice. Une fois que les dômes se sont solidifiés, ajouter des supports sur le dessus du dôme afin qu’ils soient complètement couverts.
Cultivez des organoïdes à la quantité désirée pour les applications en aval déterminant le numéro de cellule avec des méthodes de comptage standard. Lorsque les organoïdes sont prêts à l’emploi, dessinez le milieu avec une pipette Pten00 et pipette de haut en bas pour perturber la matrice membranaire du sous-sol. Transférer la suspension dans un tube conique de 15 millilitres et une centrifugeuse à 300 fois g pendant cinq minutes.
Aspirer le supernatant et laver la pastille cellulaire avec cinq millilitres de PBS. Répétez la centrifugation, puis resuspendez la pastille en quatre millilitres de remplacement de trypsine et laissez-la digérer pendant cinq à dix minutes tout en secouant à 37 degrés Celsius. Ajouter un volume égal de milieu organoïde avec 10%FBS pour inhiber le remplacement de la trypsine et centrifuger le tube à 300 fois g pendant cinq minutes.
Aspirer le supernatant et resuspendre les cellules en un millilitre de PBS. Filtrez ensuite les cellules à l’aide d’un filtre de 40 micromètres pour assurer la suspension d’une seule cellule et comptez-les à l’aide d’un hémomètre. Diluer la suspension cellulaire à 100 cellules par 10 microlitres à l’aide d’un milieu organoïde avec 10 inhibiteurs micromolaires de rho kinase Y27632.
Transférer 1100 cellules dans un nouveau tube conique et ajouter 285 microlitres de matrice membranaire du sous-sol, ce qui se traduira par une concentration matricielle de 70%. Ensuite, ensemencer les cellules dans 35 microlitres de dômes matriciels dans une plaque préchauffée de 24 puits en s’assurant de plaquer trois à cinq répliques par échantillon. Retournez la plaque et placez-la dans un incubateur cellulaire pour solidifier la matrice du sous-sol.
Après 10 minutes, retirer la plaque de l’incubateur et ajouter le milieu contenant l’inhibiteur de la rho kinase. Actualisez le milieu tous les deux jours et après sept jours, comptez le nombre d’organoïdes établis par dôme et calculez le pourcentage d’organoïdes formés à partir du nombre total de cellules. Après avoir isolé les organoïdes comme décrit précédemment, graine 1000 à 10 000 cellules dans le dôme matricielle en utilisant l’efficacité de la formation organoïde et la vitesse de croissance comme un proxy pour déterminer le nombre final de cellules.
Puis ensemencer 35 microlitres de dômes matriciels dans une plaque de 24 puits et laisser le dôme se solidifier. Ajouter le milieu contenant l’inhibiteur de rho kinase et le médicament de choix. Effectuer un journal 10 incrémentiel pour déterminer la concentration inhibitrice à moitié maximale à l’aide du véhicule dans lequel le médicament a été dissous comme un contrôle.
Rafraîchissez le milieu tous les deux à trois jours et analysez les organoïdes le septième jour pour déterminer la réponse pharmacologique au médicament en effectuant un test de viabilité cellulaire tel que décrit dans le manuscrit. Pour plaquer les fragments organoïdes sans trypsinisation, utilisez une pipette Pten00 pour aspirer le milieu et la pipette de haut en bas pour perturber la matrice membranaire du sous-sol. Lorsque la matrice est complètement perturbée, transférer la suspension dans un tube conique de 15 millilitres et une centrifugeuse à 300 fois g pendant cinq minutes.
Aspirer le supernatant et ajouter cinq millilitres de PBS. Après le lavage, resuspendez les organoïdes en un millilitre de PBS et perturbez les organoïdes par trituration avec une pipette pasteur en verre. Quantifier le nombre de fragments organoïdes et de graines cinq répliques avec 100 fragments comme décrit précédemment.
Sept jours plus tard, effectuer un test de viabilité cellulaire selon les instructions manuscrites. Les cellules basales de prostate de type sauvage ont démontré la formation organoïde supérieure comparée aux cellules luminales. Une augmentation mineure de la formation organoïde a été réalisée avec crispr-Cas9-2000 perte de Pten ou P53 et la perte des deux capacités de formation accrues.
Les effets des molécules anti androgènes sur la croissance ont été testés chez des organoïdes murins avec différents génotypes. La perte de P53 n’a pas causé de résistance aux molécules anti androgènes, mais la perte de Pten a augmenté la résistance. La double perte de P53 et de Pten, cependant, a eu comme conséquence la résistance complète.
L’inhibition des récepteurs androgènes a également modifié les phénotypes. Les organoïdes supprimés de type sauvage Pten et P53 ont démontré la diminution de la taille organoïde de lumen tandis que les organoïdes avec la perte de Pten et de P53 étaient phénotypiquement inchangés. Comme prévu, lorsque ces cellules ont été greffées sous-cutanée dans le flanc, seuls les organoïdes Pten et P53 doublement supprimés ont grandi.
Deux organoïdes distincts de cancer de la prostate humains MSKPCA2 et MSKPCA3 ont été examinés pour leur réponse aux molécules anti-androgènes. La prolifération des organoïdes MSKPCA2 a été fortement inhibée tandis que les organoïdes MSKPCA3 sont restés inchangés. MSKPCA2 a exprimé des niveaux élevés de récepteurs androgènes et FKBP5 ainsi que des protéines luminales caractéristiques.
MSKPCA3 a également exprimé des marqueurs basaux et mésenchymaux et n’a montré aucune expression de FKBP5 suggérant que ces organoïdes modélisent un phénotype non-luminal androgène-indépendant. Les organoïdes doivent être perturbés périodiquement soit par trypsinisation, soit par trituration avec une pipette en verre afin de rester viables. La fréquence dépend de l’origine et du génotype des espèces.
N’importe quel type d’expérience de séquençage ou de protéomique de prochaine génération peut être effectué selon les procédures décrites. Ces expériences étudieraient la base moléculaire des phénotypes et des réponses pharmacologiques. Cette technique tridimensionnelle de culture organoïde permet aux chercheurs d’étudier in vitro les réponses pharmacologiques dans un contexte génétique hautement contrôlé.
Cela peut être une alternative fiable à de longues études in vivo.
