Cette méthode est importante parce que les organoïdes dérivés du patient fournissent un outil rapide et puissant pour étudier les cancers urologiques car ils imitent fréquemment l’hétérogénéité génétique et phénotypique de cette maladie multispectroscopique. Les organoïdes peuvent être isolés à partir d’une quantité limitée de matériel de biopsie du patient et peuvent être rapidement étendus pour une analyse en aval. Les organoïdes générés à l’aide de ce protocole peuvent être utilisés à la fois comme modèles pour nous aider à comprendre les bases cellulaires et moléculaires des cancers urologiques et comme outils de médecine de précision pour nous permettre de prédire à quels traitements et patients individuels le cancer pourrait répondre.
Pour commencer, prélevez un échantillon de tumeur frais macroscopiquement viable de la chirurgie et assurez-vous que l’échantillon est immergé dans un milieu de transport dans un tube conique stérile de 50 millilitres ou un pot d’échantillon d’urine pendant le transit. Enregistrer les détails de l’échantillon, y compris le poids des tissus, la description de l’échantillon et les détails concernant les échantillons de sang et d’urine sur la feuille de traitement de l’échantillon du patient. Remplacez soigneusement le milieu de transport par 10 millilitres de milieu basal et laissez le tissu tumoral se déposer par gravité.
Ensuite, à l’aide de pinces, retirez le tissu tumoral et placez-le dans une boîte de Petri stérile de 90 millimètres. Notez le poids du tissu en grammes ou en milligrammes sur la feuille de traitement de l’échantillon clinique et la grille de dissection. Ensuite, en utilisant des pinces stériles dans une lame de scalpel jetable montée sur un manche de scalpel, retirez le tissu non cancéreux et les régions nécrotiques macroscopiquement visibles.
Lavez les morceaux de tumeur une ou deux fois avec du DPBS froid, puis collectez-les et transférez-les dans une nouvelle boîte de Petri stérile de 90 millimètres. Prenez une photo, dessinez un diagramme tissulaire et planifiez la dissection tissulaire sur une grille de traitement clinique. Pour l’analyse histopathologique, placez environ 50 milligrammes de tissu tumoral dans une cassette d’histologie en plastique jetable étiquetée.
Ensuite, immergez la cassette d’histologie dans un récipient avec un volume de 5X à 10X de formol tamponné neutre à 10% et incubez pendant la nuit. Le lendemain, remplacez le formol par de l’éthanol à 70% pour le stockage à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que le tissu puisse être traité. Pour l’analyse moléculaire, congeler au moins un morceau de tumeur dans une RNase, sans DNase 1,5 millilitre cryovial en utilisant de l’azote liquide et stocker à moins 80 degrés Celsius.
Ensuite, distribuez cinq millilitres de milieu organoïde dans la boîte de Petri de 90 millimètres contenant les morceaux de tumeur restants et hachez mécaniquement le tissu aussi fin que possible. à l’aide d’une lame de scalpel stérile numéro 10. Transférer le tissu finement haché dans un tube conique de 50 millilitres et ajouter quatre millilitres de milieu organoïde, un millilitre de 10X collagénase/hyaluronidase et 0,1 milligramme par millilitre de DNase I pour éviter l’agglutination cellulaire.
Incuber le tissu tumoral haché dans une solution enzymatique pendant une à deux heures sur un agitateur orbital ou un rotateur dans un incubateur pour dissocier les fragments en une suspension cellulaire et décomposer les collagènes. Arrêtez ensuite la digestion en ajoutant deux fois le volume de milieu basal à l’échantillon. Centrifugez l’échantillon, aspirez et jetez le surnageant.
Ensuite, pour lyser les globules rouges contaminants, ressuspendez la pastille dans cinq millilitres de tampon potassium au chlorure d’ammonium et incubez le tube à température ambiante pendant trois minutes ou jusqu’à ce que la lyse complète des globules rouges soit visible. Ajoutez ensuite 20 millilitres de milieu basal dans le tube. Centrifugez à nouveau et aspirez le surnageant.
À cette étape, placez une aliquote de 10 millilitres de milieu organoïde 2X et 1X dans un bain-marie de 37 degrés Celsius pour vous réchauffer. Filtrer d’abord l’échantillon à l’aide d’une passoire réversible pré-humide de 100 microns dans un nouveau tube de 50 millilitres pour éliminer les gros matériaux insolubles. Ensuite, filtrez l’éluat à travers une passoire réversible pré-humide de 37 microns pour recueillir des cellules individuelles en petits groupes pour l’isolement des cellules individuelles et immunitaires.
Ensuite, inversez la passoire de 37 microns et ajoutez 10 millilitres de milieu basal pour recueillir des grappes de petite et moyenne taille. Rechargez chacun de ces nouveaux tubes de 50 millilitres avec du DPBS à 40 millilitres, puis centrifugez la suspension et jetez le surnageant. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu basal au tube contenant les cellules individuelles et comptez les cellules à l’aide d’un colorant d’exclusion bleu de trypan dans un compteur cellulaire automatisé.
Déterminer le nombre de cellules et la viabilité des cellules. Centrifuger l’échantillon restant et remplacer le milieu par une solution de congélation cellulaire ou un milieu basocellulaire contenant 10 % de sérum bovin fœtal 1 % de pénicilline et de streptomycine et 10 % de DMSO, puis placer les échantillons dans des cryoviaux de 1,5 millilitre, les stocker dans un récipient autogelé et transférer immédiatement les récipients dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Le lendemain, transférez les cryoviaux dans un stockage cryogénique en phase liquide ou en phase d’air pour un stockage à long terme.
Ensuite, remettez en suspension les grappes de petite et moyenne taille collectées avec 500 microlitres de milieu organoïde 2X préchauffé. Ensuite, avec les embouts de pipette filtrante stérile P-1000 glacés, ajoutez du BME aux cellules et mélangez doucement. Pipeter rapidement et soigneusement 100 microlitres du mélange BME de cellules reconstituées dans des puits d’une plaque à très faible fixation, à fond plat de 96 puits, et placer la plaque dans un incubateur pendant 20 à 30 minutes pour se solidifier.
Après l’incubation, ajouter un milieu organoïde au-dessus de la suspension de cellules BME dans un rapport de un à deux selon le volume évalué empiriquement, et placer la plaque dans un incubateur pendant 20 minutes pour équilibrer. Après l’incubation, retirez la plaque de l’incubateur et assemblez-la sur un porte-échantillon sur la scène d’un microscope pour évaluer visuellement les organoïdes dans des conditions de contraste de phase ou de champ lumineux. Rechargez le milieu tous les deux à trois jours à l’aide de 50 microlitres de milieu organoïde préchauffé pour reconstituer les facteurs de croissance épuisés et le volume global.
Acquérez les images de la série time-lapse aux jours 1, 2 et 3, et 5, 7 et 10 avant le passage. La digestion de deux heures du tissu cancéreux de la vessie avec la collagénase / hyaluronidase disponible dans le commerce et la DNase I conduit à une digestion suffisante de morceaux de 0,5 à 1 millimètre cube de tissu de biopsie de cystectomie plus complexe, y compris les cellules néoplasiques dans la lamina propria et les couches musculaires de la vessie. Les fragments post-digestion plus grands conviennent à la culture et aux plaques de culture tissulaire standard de toute taille pour isoler de nouvelles cultures bidimensionnelles.
Les organoïdes générés par cette procédure subissent un auto-assemblage dynamique, y compris des phases d’agrégation, de compactage et de formation finale de structures cellulaires serrées. Histologiquement, ces structures récapitulent la tumeur du patient d’origine. Les organoïdes générés dans cette procédure conviennent à de nombreuses fins, y compris la caractérisation histopathologique supplémentaire, la biobanque et les tests d’efficacité des médicaments.
Après la génération d’organoïdes, des méthodes supplémentaires peuvent être utilisées pour profiler ces tumeurs, y compris le rôle des thérapies anticancéreuses, le profilage métabolique ou le profilage de transcription. Dans ce cadre 3D, ces méthodologies supplémentaires fournissent des informations puissantes sur la biologie du cancer de la vessie. Cette méthode a été une base importante pour les études portant sur l’immuno-oncologie et le métabolisme cellulaire.
