Le système organoïde 3D est considéré comme plus pertinent physiologiquement que les tests 2D, et il peut fournir des informations précieuses sur la biologie qui serait autrement difficile à acquérir. Il s’agit d’un système adaptable où nous pouvons tester des manipulations pharmacologiques et génétiques avec moins de temps et un coût significativement inférieur à l’utilisation d’une approche in vivo. L’essai matrix est très difficile à manipuler, car il se solidifie lorsqu’il atteint la température ambiante.
Il ne peut être tiré à travers une pipette que lorsqu’il est liquide et doit être maintenu sur la glace. L’intégrité de l’anneau est importante à maintenir. Si la structure est perturbée, cela peut affecter négativement la croissance organoïde, et vous pouvez facilement perdre du matériel lorsque vous changez de média.
Commencez cette procédure avec la préparation des cellules épithéliales basales et luminales de prostate de souris telles que décrites dans le protocole de texte. Lavez la pastille cellulaire dans 500 microlitres de médias organoïdes de souris, puis suspendez la pastille à une densité cellulaire de 1000 cellules par microlitre. Pour préparer les mélanges maîtres, mélanger les cellules épithéliales suspendues dans des supports organoïdes de souris avec du gel matricielle pour générer un mélange final qui contient 25% de cellules dans les médias et 75% de gel matriciel.
Selon l’application en aval, les cellules basales sont généralement plaquées à une concentration de 100 à 2000 cellules pour 80 microlitres, tandis que les cellules luminaires sont plaquées à une concentration de 2000 à 10 000 cellules pour 80 microlitres. Pour chaque mélange cellulaire, ajouter 80 microlitres du gel matriciel par puits d’une plaque de 24 puits. Pipette une gouttelette sur la moitié inférieure du mur du puits tout en évitant tout contact direct avec le revêtement poly-héma.
Après avoir ajouté le gel matricielle, faites tourbillonner la plaque pour permettre au mélange de cellules de gel matricielle de former un anneau autour du bord du puits. Placez la plaque de 24 puits dans un 37 degrés Celsius, 5%C02 incubateur côté droit pendant 10 minutes pour permettre au gel matricielle de durcir partiellement. Après avoir incubé pendant 10 minutes, retourner la plaque de 24 puits à l’envers et incuber pendant 50 minutes supplémentaires pour permettre au gel matricielle de durcir complètement.
Ensuite, ajoutez 350 microlitres de médias organoïdes de souris préchauffés au centre de chaque puits. Après avoir ajouté les supports, retournez la plaque de 24 puits à l’incubateur. Pour reconstituer les supports organoïdes de la souris, inclinez la plaque de 24 puits à un angle de 45 degrés et retirez doucement les supports existants du centre de chaque puits à l’aide d’une pipette P1000 tout en évitant l’anneau de gel matriciel.
Ajoutez 350 microlitres de supports organoïdes de souris préchauffés comme avant. Il est recommandé d’ajouter un plus grand volume de médias aux organoïdes cultivés pendant plus de cinq jours afin de prévenir l’épuisement rapide des principaux nutriments et facteurs de croissance. Retirez les supports de chaque puits comme avant.
Pour recueillir les organoïdes, faites sauter à plusieurs reprises le gel matricielle en pipetant un millilitre de supports antipase préchauffés directement sur l’anneau de gel matricielle jusqu’à ce que l’anneau entier soit délogé. Transférer le mélange organoïde de gel matriciel délogé dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre. Après une digestion complète comme décrit dans le protocole de texte, ajouter la solution saline tamponnée de phosphate à la pastille organoïde, et re-suspendre en feuilletant doucement.
Pelleter les organoïdes par centrifugation à 800 fois G pendant cinq minutes à température ambiante, et enlever le supernatant à l’aide d’une micro-pipette. Suspendre à nouveau les granulés organoïdes dans 100 microlitres de tampon de lyse protéique par 10 microlitres de volume cellulaire emballé. Feuilletez pour suspendre à nouveau.
Maintenant, soniquez les organoïdes en vantant les tubes dans la glace humide et en appliquant doucement la pointe du dismembrator sonore à l’extérieur du tube de micro-centrifugeuse. Sonicate pendant 40 secondes à 20 kilohertz avant de procéder à des ballonnements occidentaux avec des protocoles établis. Pour recueillir les organoïdes de la prostate dans les plaques de 24 puits, retirez le média de chaque puits comme avant.
Digérer le gel matricielle en couveant avec 500 microlitres de médias contenant de la dispase pendant 30 minutes dans un incubateur de 37 degrés Celsius et de 5 % de CO2. Recueillir la suspension organoïde digérée dans un tube de micro-centrifugeuse. Ensuite, pelleter les organoïdes par centrifugation à 800 fois G pendant trois minutes à température ambiante, et enlever le supernatant.
Pour effectuer la coloration immunofluorescente de montage entier des organoïdes de prostate, ajoutez d’abord 500 microlitres de 4% paraformaldéhyde dans PBS. Incuber les organoïdes pendant deux heures à température ambiante avec des secousses douces. Après avoir lavé la pastille comme décrit dans le protocole de texte, ajouter un microgramme par millilitre de tache DAPI dans la solution de blocage, et incuber pendant deux heures à température ambiante.
Protégez l’échantillon de la lumière pendant l’incubation de ce pas en avant. Après centrifugation des organoïdes comme avant, ajouter l’anticorps primaire dans la solution de blocage et incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec des secousses douces. Pelleter les organoïdes à nouveau, et laver la pastille avec un millimètre de PBS pendant 15 minutes avec des secousses douces.
Répétez cette procédure de lavage deux fois. Ajouter ensuite l’anticorps secondaire dans la solution de blocage, et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius avec des secousses douces. Après l’incubation, pelleter les organoïdes, et laver la pastille pour deux fois supplémentaires.
Ajouter un millilitre de 30% saccharose en PBS avec 1%Triton X-100 aux organoïdes granulés. Puis incuber pendant deux heures à température ambiante avec des secousses douces. Après avoir granulé les organoïdes à nouveau, ajouter un millimètre de 45% saccharose en PBS avec 1%Triton X-100, et secouer doucement pendant deux heures à température ambiante.
Ensuite, répétez la procédure, sauf ajouter un millilitre de 60% saccharose en PBS avec 1%Triton X-100. Pelleter les organoïdes par centrifugation à 800 fois G pendant trois minutes à température ambiante, et enlever 95% du supernatant. Observez la pastille sous la lumière UV pour confirmer qu’elle n’a pas été perdue lors de l’enlèvement du surnatant.
La pastille devient plus lâche à mesure que la concentration de saccharose devient plus élevée. Transférer 10 à 20 microlitres de la suspension restante dans un coverslip chambé et procéder à une microscopie confoccale. Les cellules basales et luminales forment des organoïdes avec des morphologies distinctes.
Tandis que la plupart des organoïdes basiques-dérivés sont semblables dans la taille après sept jours dans la culture, les organoïdes luminal-dérivés montrent l’hétérogénéité significative. En outre, la plupart des organoïdes dérivés basiques contiennent des lumens entourés d’épithélium multicououche, tandis que les organoïdes dérivés de la luminale vont de creux avec épithélium à une seule couche à solide avec des cordons multicou couches de cellules qui ne canalisent pas. L’analyse occidentale de tache a indiqué que les organoïdes basiques et luminal-dérivés retiennent des dispositifs liés aux cellules primaires basales et luminales.
Les organoïdes basal-dérivés expriment des niveaux plus élevés du marqueur basal cytokeratin 5, tandis que les organoïdes luminal-dérivés expriment des niveaux plus élevés du cytokeratin luminal de marqueur 8. Des marqueurs basiques et luminaux ont été détectés dans les organoïdes basiques et luminal-dérivés dans la population en vrac, peut-être suggestif de la différenciation. Les organoïdes basal-dérivés contiennent l’épithélium multicouche, avec des couches externes exprimant des niveaux élevés du marqueur basal p63, et des couches intérieures ayant des niveaux non détectables.
Les couches externes expriment également des niveaux modérés du marqueur luminal cytokeratine 8, et les couches intérieures ont des niveaux élevés. Tandis que toutes les cellules dans les organoïdes luminal-dérivés d’une seule couche tachent positivement pour la cytokeratine 8, seulement les cellules sélectionnées ont contenu le p63 nucléaire. Il faut prendre soin lors de la manipulation du gel matricielle pour s’assurer qu’il ne durcit pas avant le placage des cellules dans la culture organoïde.
Dapi utilisé pour la microscopie peut causer une irritation de la peau. La lumière UV peut également être nocive. Un équipement de protection individuelle adéquat est essentiel.
Nous pouvons recueillir l’ARN des organoïdes pour effectuer le séquençage d’ARN, qui nous dira comment les profils d’expression de gène changent pendant la formation organoïde ou en réponse à la manipulation. Ce modèle a permis au champ de la prostate d’avoir un essai ex vivo reproductible pour étudier les aspects fondamentaux de la biologie épithéliale et identifier les régulateurs dans le développement et la différenciation.
