L’endomètre est un tissu qui change chaque mois en réponse aux hormones. Le déséquilibre hormonal peut empêcher l’attachement d’embryon et également causer des maladies comme le cancer. Notre protocole reconstruit l’endomètre afin qu’il puisse être étudié en dehors du corps de la femme d’une manière physiologique.
Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une structure 3D de cellules composées de deux types de cellules hormonalement sensibles, les cellules épithéliales et stroma qui organisent et se comportent spécifiquement comme elles le font dans le corps. Puisque les organoïdes peuvent mieux imiter le comportement des tissus, ils peuvent éventuellement être utilisés pour tester différents médicaments. Les organoïdes endométrials peuvent être utilisés pour étudier les effets directs des facteurs de risque actuellement connus pour le cancer, y compris l’obésité et le syndrome ovarien polykystique.
Nos organoïdes soulignent l’importance des actions paracrines entre deux types de cellules. Il est important de commencer avec une quantité suffisante de tissu. Obtenir la bonne densité de cellules épithéliales et stromales peut être délicat.
En outre, les organoïdes sont assez petits et peuvent être difficiles à visualiser avec la coloration de l’IHC. La visualisation de cette procédure est importante parce qu’il ya quelques étapes qui seront beaucoup plus faciles à comprendre après les avoir vus. Il s’agit notamment d’obtenir la bonne couche tissulaire de l’utérus, obtenir la bonne densité de cellules à combiner, et l’ensemencement des moisissures agarose.
Avant de commencer l’isolement cellulaire, moulage et équilibrage 1,5% agarose micro-moules selon les instructions du fabricant pour abriter les organoïdes. Dans une armoire de biosécurité, utilisez des techniques aseptiques pour préparer une solution enzymatique à 37 degrés Celsius et filtre stérile la solution à l’aide d’un filtre à seringues de 0,2 micromètre dans un tube conique de 15 millilitres. À l’aide d’un scalpel, gratter l’endomètre des biopsies utérine et émincer le tissu en très petits morceaux.
Placez le tissu fraîchement haché dans le tube conique de 15 millilitres contenant la solution enzymatique. Fermez le bouchon et enveloppez le dessus du tube avec un film de cire pour éviter la contamination. Placez le tube dans un bain d’eau ou un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes en secouant doucement.
Après cela, empilez une passoire cellulaire de 100 microns sur une passoire cellulaire de 20 microns sur un tube conique de 50 millilitres. Filtrer la solution à travers les deux passoires. Rincez le tube conique de 15 millilitres avec le HBSS et placez ce lavage à travers la passoire pour vous assurer que toutes les cellules sont collectées.
Ensuite, inverser la passoire cellulaire de 20 microns sur un nouveau tube conique de 50 millilitres et laver les cellules épithéliales de la passoire avec 20 millilitres de médias organoïdes complétés par 1% de pénicilline et de streptomicine. Centrifuger les tubes coniques à 500 G pendant cinq minutes. Pour les cellules stromales collectées, enlever le supernatant et résuspendre la pastille en 10 millilitres de tampon de lyse des globules rouges.
Incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Centrifuger ces cellules à 500 G pendant cinq minutes. Retirer le supernatant et réutiliser la pastille avec 200 à 300 microlitres de médias organoïdes.
Pour les cellules épithéliales collectées, enlever le supernatant et résuspendre la pastille dans 100 microlitres de médias organoïdes. Après que les moules d’agarose de 1,5% soient équilibrés, enlevez le milieu organoïde à l’extérieur des moules d’agarose et inclinez la plaque de culture de tissu de sorte que le milieu de la chambre d’ensemencement cellulaire des plats d’agarose puisse également être soigneusement enlevé. Visualisez les suspensions cellulaires épithéliales et stromales au microscope et ajoutez plus de supports organoïdes aux suspensions, en vous assurant d’ajouter seulement 100 microlitres à la fois de sorte que la suspension soit à peu près égale en densité.
Combinez ensuite une partie des cellules stromales avec trois parties des cellules épithéliales par volume. Pipette 50 microlitres de la suspension cellulaire combinée dans la chambre d’ensemencement cellulaire du moule agarose. Une fois que les moules agarose sont remplis de cellules, ajouter soigneusement 400 microlitres de médias organoïdes frais dans les puits de la plaque de 24 puits.
Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone, en s’assurant de changer le milieu tous les deux jours avec 500 microlitres de médias organoïdes. Après sept jours, changer le milieu à celui qui est complété par 0,1 nanomolaire estradiol et 0,8 nanomolaire testostérone pour promouvoir l’organisation des cellules épithéliales et stromales. Tout d’abord, dissoudre 1,5% agarose dans PBS par ébullition.
Placez le liquide agarose dans un bécher d’eau chaude et laissez-le refroidir à environ 50 degrés Celsius. Sous un microscope disséquant, inclinez la plaque de 24 puits et pipette soigneusement le milieu de l’extérieur du moule agarose. Puis pipette soigneusement le milieu de l’intérieur du moule agarose pour éviter de perturber les organoïdes.
Ajouter soigneusement entre 70 et 75 microlitres de chaud, 1,5% agarose dans la chambre du plat agarose, en prenant soin de ne pas déranger les organoïdes. Laisser refroidir la plaque à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après cela, ajouter 4% paraformaldéhyde dans chaque puits de la plaque de 24 puits et fixer l’ensemble scellé moule agarose nuit à quatre degrés Celsius.
Le lendemain, conservez la plaque à 70 % d’éthanol à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à être mélangée à la paraffine. Pour commencer l’isolement de l’ARN, visualisez la plaque sous un microscope disséquant. Inclinez la plaque et pipette soigneusement sur le milieu de la chambre du moule agarose.
Pipette avec force un millilitre de milieu organoïde frais directement dans le moule agarose de sorte que les organoïdes sont rincés hors des microwells, en prenant soin de ne pas créer trop de bulles. Répétez ce processus de pipetage énergique une fois à l’aide du même support. Après cela, recueillir tout le milieu contenant les organoïdes.
Centrifugeuse à 500 G pour recueillir les organoïdes, et procéder à l’extraction de l’ARN. Dans cette étude, des organoïdes endométrials humains composés des cellules épithéliales et stromal de l’endomètre sont générés sans l’utilisation des matériaux exogènes d’échafaudage. Pour le traitement histologique, les moules d’agarose contenant les organoïdes endométrials sont scellés avec l’agarose, suivis de la fixation avec 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit.
Ces moules sont traités pour l’intégration standard de paraffine sectionnée et souillée pour l’histologie, l’immunofluorescence, ou l’immunohistochimie. L’hématoxyline dans la coloration de l’éosine révèle une structure sphéroïde avec une seule couche de cellules tapissant l’extérieur et les cellules au centre. Les marqueurs spécifiques aux cellules pour les cellules endométriales, épithéliales et stromal révèlent des cellules épithéliales entourant l’organoïde avec des cellules stromales au centre.
Les marqueurs de la physiologie endométriale confirment que les organoïdes endométrials ont conservé certaines caractéristiques du tissu indigène. La coloration trichrome, qui tache le bleu collagène et les cellules rouges, montre la présence de collagène dans le centre où résidaient les cellules stromales, démontrant la production active et la sécrétion de collagène par des cellules stromales similaires au tissu indigène. En outre, la coloration immunohistochimique révèle la présence des récepteurs d’oestrogène, des récepteurs d’androgène, et des récepteurs de progestérone dans les cellules épithéliales et stromal.
Il est important de plaquer les cellules densément afin que nous avons assez d’organoïdes pour les expériences en aval. Cela prendra un peu de pratique. Les organoïdes endométrials peuvent être cultivés dans différentes conditions, puis récoltés pour des expériences comme l’immunohistochimie ou la coloration immunofluorescence pour étudier l’expression des protéines ou récoltés pour l’ARN pour étudier l’expression des gènes.
Notre laboratoire étudie comment l’endomètre réagit aux niveaux modifiés d’hormone, qui peuvent mener à l’hyperplasie endométriale et au cancer. Nous pouvons employer ces organoïdes pour des traitements à long terme des hormones et ajouter des conditions pathologiques telles que la testostérone excédentaire trouvée dans le syndrome ovarien polycystic, ou des signaux des adipocytes pour étudier des changements endométrials obésité-induits. Les tissus humains sont considérés comme biodangereux, et il sera important de prendre les précautions appropriées.
