Notre méthode est significative parce qu’elle permet aux chercheurs d’isoler et de manipuler différents types de cellules pour l’étude de leurs contributions individuelles de lignée à la forme et à la fonction des tissus. Cette technique est une méthode douce et efficace pour séparer les types de cellules et, par conséquent, l’intégrité des cellules est préservée pour la culture 3D. Cette technique peut également être appliquée à d’autres systèmes pour isoler les cellules qui n’ont pas de biomarqueurs bien caractérisés.
Pour récolter les glandes mammaires numéro deux, trois, quatre et cinq d’une souris femelle de 10 à 14 semaines, faites d’abord une incision d’un centimètre à la ligne médiane entre les deux limites postérieures. Étendre la coupe jusqu’au cou et faire de petites coupures latérales de l’incision médiane vers les membres. Puis étirer la peau enseignée avant de la fixer avec une épingle de chaque côté de l’animal.
À l’aide de forceps, recueillir les ganglions lymphatiques à partir des glandes numéro quatre. Pour enlever les glandes mammaires, utilisez des ciseaux pointus pour couper sous chaque région de tissu, plaçant les tissus dans 50 millilitres de quatre degrés Celsius DMEM-F12 complétés par 5%FBS et antibiotique-antimycotique comme ils sont récoltés. Lorsque tous les tissus ont été recueillis, hacher les glandes jusqu’à ce que les morceaux peuvent s’adapter facilement à travers une pointe pipette d’un millilitre tournant la plaque si nécessaire de sorte que tous les tissus sont hachés uniformément.
Ensuite, transférez les fragments en trois millilitres de milieu de digestion dans un seul puits d’un plat d’adhérence de six puits bas pendant 14 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain matin, pipette doucement les tissus 10 fois avec une micropipette d’un millilitre et transférer les fragments de tissu dans un tube de 15 millilitres. Recueillir le tissu par centrifugation et resuspendre la pastille en cinq millilitres de DPBS frais.
Filtrer la suspension à travers une passoire à cellules en nylon pré-humide de 70 micromètres, rinçant le tube dans la passoire quatre fois avec 10 millilitres de 37 degrés Celsius DMEM-F12 par lavage. Pour libérer les fragments de tissu, maintenez l’onglet de la passoire avec des doigts gantés et inversez la passoire sur un plat de culture tissulaire de 60 millimètres. Passez quatre aliquots d’un millilitre de milieu d’entretien par le fond de la passoire et examinez rapidement le plat pour les cellules simples, les gouttelettes de graisse, et le tissu contaminant sous un microscope inversé.
Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures pour permettre aux fragments de tissu d’adhérer au plat et de générer des fragments de bilayered. Pour séparer les cellules myoepithelial des cellules épithéliales luminales, rincez le plat avec un millilitre de DPBS avant d’ajouter un millilitre de trypsine-EDTA frais de 0,5% aux cellules. Surveillez attentivement la digestion au microscope inversé.
La couche externe des cellules myoepithelial commencera à se détacher dans les trois à six minutes. Lorsque les cellules myoepithelial se sont détachées, transférer le supernatant dans un tube de 15 millilitres contenant deux millilitres de 10%FBS dans DPBS. Sans déranger les cellules épithéliales luminales, rincer délicatement le plat avec deux millilitres de DPBS avant d’ajouter un millilitre frais de trypsine-EDTA aux cellules restantes.
Après sept à 15 minutes, étanchez la réaction enzymatique avec deux millilitres de 10%FBS dans PBS et transférez les cellules à un nouveau tube de 15 millilitres. Il est essentiel de surveiller de près les cellules pendant la trypsinisation différentielle et de ne pas trop digérer les cellules. Lorsque les deux fractions ont été collectées, centrifuger les cellules pour éliminer tout réaménageur de dissociation résiduelle et résuspendre les granulés dans 250 microlitres de milieu d’entretien par tube.
Après comptage, diluer chaque population cellulaire à 1,2 fois 10 à quatre cellules par concentration de puits dans un milieu d’entretien frais. Ajouter 90 microlitres de matrice extracellulaire à 50 % dans DMEM-F12 sans rouge phénol à chaque puits d’une glissière de chambre de huit puits. Lorsque tous les puits ont été enduits, solidifier la couche de base dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 30 minutes.
Au cours de cette polymérisation, recueillir les fractions cellulaires par centrifugation et résuspendre chaque population en 100 microlitres de matrice extracellulaire de 10% dans 90% milieu de croissance par puits. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de chaque suspension cellulaire à chaque puits et permettez aux co-cultures de se contenter de 20 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. À la fin de l’incubation, ajouter soigneusement 100 microlitres de milieu de croissance sur le côté de chaque mur de chambre et retourner la diapositive à l’incubateur de culture cellulaire.
Imagez les cellules toutes les 24 heures pour suivre leur croissance et renouveler doucement le milieu de croissance tous les deux à trois jours. Pour fixer les organoïdes pour l’immunostaining, au moment expérimental approprié, aspirez soigneusement le milieu de chaque diapositive pour être photographié et rincez chaque puits avec 200 microlitres de DPBS par puits. Fixer les organoïdes avec 200 microlitres de quatre degrés Celsius paraformaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante avant de traiter les organoïdes avec 200 microlitres de 0,2% glycine en DPBS par puits pendant 30 minutes à température ambiante.
À la fin de l’incubation, perméabiliser les organoïdes avec 0,25% triton X-100 dans DPBS pendant 10 minutes à température ambiante suivie par le blocage de liaison non spécifique avec 5% sérum âne ou le sérum approprié qui correspond à l’espèce de l’anticorps secondaire dans DPBS pendant une heure avec basculement. Ensuite, étiquetez les cellules avec 125 à 200 microlitres des anticorps primaires appropriés d’intérêt dans le sérum d’âne de 1% dans DPBS pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec basculement. Le lendemain matin, lavez chaque puits deux fois avec 200 microlitres de DPBS plus triton X-100 avant d’étiqueter les organoïdes avec les anticorps secondaires conjugués à fluorescence appropriés pendant 45 minutes à température ambiante avec basculement protégé de la lumière.
Ensuite, lavez chaque puits deux fois avec du DPBS frais plus triton X-100 comme démontré et l’image des organoïdes par microscopie fluorescence selon les protocoles standard. Après 24 heures d’incubation, des fragments épithéliales purifiés ont adhéré au fond du plat de culture formant des structures plates en forme de crêpes avec une couche externe de cellules myoepithelial encerclant une couche interne de cellules épithéliales luminales. Le traitement à la trypsine détache différentielle les cellules avec les cellules myoepithelial se détacher en premier et apparaissant comme des cellules arrondies lumineuses qui encerclent le noyau des cellules épithéliales cuboïdes restantes.
La pureté globale des deux compartiments cellulaires est d’environ 90 %, selon l’expression de la kératine-14 et de l’É-cadhérine dans les deux populations. Après 10 jours de culture dans la matrice extracellulaire de 10% sur une base extracellulaire de matrice de 50%comme démontré, les organoïdes épithéliales épithéliales myoepithelial de cellules ont formé de grandes structures ramées avec des lumens bien développés. La différenciation au cinquième jour avec l’ajout d’un milieu d’alvélogenèse induit la formation d’organoïdes plus gros et plus ram ram ramés contenant du lait.
Il est important de se rappeler de laver soigneusement la passoire lors de la collecte de l’épithélium pour s’assurer qu’il n’y a pas de contaminants stromaux. Pour interroger les changements dans l’expression des gènes, les chercheurs peuvent recueillir l’ARN des organoïdes en les libérant de la matrice extracellulaire à l’aide d’une solution de récupération. Le paraformaldéhyde est considéré comme dangereux et les chercheurs devraient utiliser de l’équipement de protection individuelle et travailler à l’intérieur d’un capot de fumée lors de l’utilisation de ce réaccène.
