Nous remercions le personnel du Centre mondial de référence pour les virus et arbovirus émergents (WRCEVA) : Dr Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr Kenneth Plante, Dr Jessica Plante, Dionna Scharton et Divya Mirchandani, pour leur travail inlassable dans la conservation et la fourniture de nombreuses souches virales utilisées pour nos expériences de compétence vectorielle et celles d’autres groupes. Le travail présenté a été financé par le McLaughlin Fellowship Fund (SRA) et les subventions des NIH AI120942 et AI121452.

Toutes les procédures effectuées dans le cadre de ces protocoles ont été effectuées en pleine conformité avec les protocoles approuvés par le Comité institutionnel de biosécurité et le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la branche médicale de l’Université du Texas à Galveston.
1. Amplifier le ZIKV dans les cellules Vero
<ol><li>Cultiver des cellules Vero (CCL-81 ou VeroE6) dans la modification par Dulbecco du milieu essentiel minimal (DMEM) d’Eagle complété par 10% v/v de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS) et 1% (v/v) de pénicilline-streptomycine (100 U/mL et 100 μg/mL, respectivement) dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2 à une confluence comprise entre 80 et 90% dans une fiole de culture tissulaire de 150 cm2.</li>
	<li>Dans une armoire de biosécurité (ESB), retirer le milieu et éliminer soit dans de l’eau de Javel à 10 %, soit dans une dilution de travail de l’ammonium quaternaire double(Table des matériaux). Inoculer immédiatement la monocouche avec 1 mL de stock viral, en visant 0,1−1 particule virale infectieuse par cellule. Agiter immédiatement la fiole de telle sorte que l’inoculum entre en contact avec la monocouche dans son intégralité.</li>
	<li>Complétez le milieu jusqu’à un volume de 5 mL à l’aide de DMEM complété par un FBS inactivé par la chaleur de 2 % v/v et une pénicilline-streptomycine à 1 % (v/v). Déplacez ensuite la fiole dans l’incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 60 min.</li>
	<li>Retirez la fiole de l’incubateur et apportez-la dans un ESB. Ajouter un milieu supplémentaire à un volume total de 15 mL à l’aide de DMEM complété par un FBS inactivé par la chaleur de 2 % v/v et une pénicilline-streptomycine à 1 % (v/v). Déplacer la fiole dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2.</li>
	<li>Examiner la fiole quotidiennement en microscopie à contraste de phase pour détecter des effets cytopathiques (EPC). Procéder à la récolte virale (étape 1.7) lorsqu’il ne reste qu’environ 40 à 50 % des cellules dans la monocouche, généralement 3 à 5 jours après l’infection, selon la souche de ZIKV utilisée.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et le placer dans un flacon conique de 50 mL. Clarifier le surnageant des débris cellulaires par centrifugation (3 500 x g pendant 20 min). REMARQUE: Si plusieurs flacons ont été infectés de manière identique, les surnageants de plusieurs flacons peuvent être combinés en tubes coniques de 50 mL.</li>
	<li>Retirez le surnageant du tube conique de 50 mL pour le faire sortir d’un tube frais, en prenant soin de ne pas perturber la pastille. Complétez le surnageant avec du FBS inactivé par la chaleur jusqu’à une concentration finale de 30% (v / v). Aliquoter ce mélange dans des tubes de bouchon à vis individuels et congeler à -80 °C jusqu’à utilisation.</li>
</ol>2. Préparation de farines de sang artificielles
<ol><li>Le jour où les moustiques doivent être exposés à des farines sanguines infectieuses, allumez la source d’alimentation (Table des matériaux) dans une installation de confinement des arthropodes de sorte que les unités d’alimentation (Table des matériaux) soient préchauffées au moment où les moustiques sont préparés pour l’exposition.</li>
	<li>Préparez des farines de sang artificielles en utilisant l’une des méthodes décrites ci-dessous.<ol>
<li>Méthode 1 : Mélanger du sang humain fraîchement récolté (dans un délai d’une semaine) citré ou héparinisé acheté dans le commerce 1:1 v/v avec du matériel viral (préparé comme décrit à la rubrique 1). REMARQUE: Cette méthode est subordonnée à l’absence d’anticorps contre la famille de virus / virus présents dans le sang.</li>
		<li>Si l’absence d’anticorps ne peut être confirmée ou si la source de sang est connue pour avoir déjà été exposée au flavivirus, laver et emballer manuellement les érythrocytes.<ol>
<li>Dans un ESB, ajouter 30 mL de sang humain total dans un tube conique de 50 mL et compléter jusqu’à 50 mL avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
			<li>Centrifuger à 3 500 x g pendant 20 min.</li>
			<li>Aspirer le surnageant soit en versant doucement dans un plateau contenant soit 10% d’eau de Javel, soit en travaillant une dilution d’ammonium quaternaire double, en prenant soin de ne pas jeter la pastille érythrocytaire.</li>
			<li>Ajouter 10 mL de PBS et tapoter doucement le fond du tube conique contre le fond du BSC de manière à reconstituer la pastille érythrocytaire. Porter le volume de la suspension jusqu’à 50 mL avec PBS. Mélanger par inversion douce.</li>
			<li>Répétez les étapes 2.2.2.1−2.2.2.4 un total de 4−6x. Confirmez que le surnageant est clair ou seulement légèrement rose et n’est plus opaque. Retirez tout le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique. Remettre en suspension la pastille érythrocytaire dans 1−2 mL de PBS.</li>
			<li>Assembler la farine de sang : 350 μL d’érythrocytes emballés, 100 μL de saccharose à 10 %, 200 μL de FBS inactivé par la chaleur, 900 μM d’ATP recombinant et 2 mL de stock de virus dilué de manière appropriée à l’aide de DMEM complété par un FBS inactivé par la chaleur à 2 % v/v et de 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Superposez une unité de réservoir standard de 3 mL(Table des matériaux)avec la peau d’une souris non infectée (d’autres options incluent un film de paraffine, des membranes collagènes ou un boyau de saucisse).</li>
	<li>Placez le réservoir couvert sur des serviettes en papier blanc. Ajouter ~2 mL de farine de sang infectieuse au réservoir 1 mL à la fois. Inspectez la serviette sous le chargeur pour détecter toute preuve de fuite. Si des fuites sont présentes, récupérez la farine de sang des mangeoires et jetez les couvercles. Scellez les mangeoires avec des bouchons. Une fois de plus, confirmez qu’aucune fuite n’est présente.</li>
</ol>3. Contre-titrage des farines de sang/dosage de la plaque
<ol><li>En utilisant le volume restant de la farine de sang préparée, effectuer une série de dilution en série 10x (c.-à-d. 6 dilutions, allant de dilué 10x à 1 000 000x) en utilisant du DMEM complété par un FBS inactivé par la chaleur de 2% v / v et 1% (v / v) de pénicilline-streptomycine.</li>
	<li>Aliquote 100 μL des dilutions dans les puits de 24 ou 12 plaques de puits de la plus diluée à la plus concentrée.</li>
	<li>Incuber pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2.</li>
	<li>À la fin de la période d’incubation de 1 h, ramener les plaques dans le BSC et ajouter 1 mL ou 2 mL de superposition de méthylcellulose aux plaques de 24 puits ou 12 puits, en conséquence.</li>
	<li>Replacez les plaques superposées dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 et incubez pendant 3 à 7 jours (en fonction de la souche virale).</li>
	<li>Après l’incubation, retirez les plaques de l’incubateur et apportez-les dans le BSC. Jeter la superposition de méthylcellulose dans un plateau contenant 10% d’eau de Javel ou un désinfectant à double ammonium quaternaire.</li>
	<li>Lavez chaque puits 2x avec du PBS, en jetant le lavage dans un bac contenant 10% d’eau de Javel ou d’ammonium quaternaire double.</li>
	<li>Ajouter ~1 mL de méthanol:acétone (1:1 v:v) et laisser les cellules se fixer sur plaque pendant au moins 30 min dans le BSC à température ambiante (RT). Jeter le méthanol: acétone selon la politique institutionnelle sur les déchets organiques.</li>
	<li>Visualisez ZIKV à l’aide de l’une des deux méthodes décrites ci-dessous.<ol>
<li>Après l’élimination du méthanol:acétone, tacher immédiatement avec une solution de violet cristallin (0,25% p/v dans 30% de méthanol) pendant 5 min. Rincer 2x à l’eau du robinet et laisser sécher, puis visualiser directement à l’œil nu pour détecter les signes de plaques ou de destruction de monocouche.</li>
		<li>Alternativement, effectuez un test de formation de mise au point.<ol>
<li>Laissez les plaques sécher à l’air libre jusqu’à ce qu’il ne reste plus de fixateur organique. REMARQUE: Cela devrait prendre environ 2−3 h à l’extérieur de l’ESB, mais peut être accéléré par séchage à l’air dans une hotte BSC ou chimique.</li>
			<li>Lavez chaque puits 3x pendant 15 min chacun dans du PBS non stérile (sans Mg2+ et Ca2+) sur une bascule à plaque orbitale. Retirer le PBS et ajouter 1 mL de solution bloquante (PBS + 3% FBS) à chaque puits et roche pendant 15 min à RT.</li>
			<li>Ajouter 100 μL par puits d’anticorps primaire α-ZIKV ou α-flavivirus (p. ex. hybridome du groupe flavivirus D1-4G2-4-15 [4G2]) à une dilution de 1:2 000 en solution bloquante. Incuber avec bascule pendant un minimum de 4 h (de préférence pendant la nuit, ne dépassant pas 18 h) à RT.</li>
			<li>Retirez l’anticorps primaire et lavez 3x pendant 15 minutes chacun avec du PBS (sans Mg2+ et Ca2+) sur une bascule à plaque orbitale.</li>
			<li>Ajouter 100 μL par puits de l’anticorps secondaire (marqué HRP de chèvre α souris) dilué à 1:2 000 dans un tampon bloquant. Incuber avec bascule pendant 1 h à RT.</li>
			<li>Lavez 3x pendant 15 min chacun avec PBS (Mg2+ et Ca2+ libre) sur une bascule à plaque orbitale.</li>
			<li>Aliquote 100 μL de réactif de développement du substrat (Table des matériaux) par puits. Plaques rocheuses à RT pendant 15 min.</li>
			<li>Arrêtez la réaction lors du développement des foyers / plaques en retirant le substrat et en rinçant les plaques 2x avec de l’eau du robinet. Versez l’eau du robinet et laissez sécher les plaques à l’air libre avant de quantifier.</li>
			<li>Compter les foyers viraux pour déterminer le nombre d’UFC présents dans l’échantillon donné.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Administration de farines sanguines
<ol><li>Utilisez les moustiques Ae. aegypti 2 à 4 jours après l’eclosion. Trier les moustiques femelles dans des cartons de 0,5 L avec des couvercles grillagés et les priver de sucre (généralement 36 à 48 h avant la farine de sang infectieuse). Fournir de l’eau ad libitum via des boules de coton saturées d’eau.</li>
	<li>Retirez les boules de coton saturées d’eau le matin où les moustiques seront exposés à la farine de sang infectieuse.</li>
	<li>Fixez des réservoirs contenant des farines de sang artificielles aux fils de l’unité d’alimentation dans une boîte à gants en plastique transparent.</li>
	<li>Dans la boîte à gants, placez un carton de 0,5 L avec un couvercle grillagé, contenant 50 à 100 moustiques Ae. aegypti affamés, sous l’unité d’alimentation fixée au réservoir. REMARQUE: Les moustiques affamés de manière appropriée se nourrissent généralement dans les 20 minutes. L’alimentation peut être prolongée au besoin pour augmenter la taille de l’échantillon dans les populations plus lentes, bien que cela ne devrait pas s’étendre au-delà de 60 minutes, car le titre viral (ZIKV) peut diminuer dans le chargeur après environ 60 minutes.</li>
	<li>À la fin de l’alimentation, retirez le réservoir et immergez-le dans de l’eau de Javel fraîchement préparée à 10%.</li>
	<li>Anesthésie à froid des moustiques par incubation pendant 30 s à -20 °C ou pendant 5 min au réfrigérateur.</li>
	<li>Dans la boîte à gants, versez les moustiques dans une boîte de Petri sur de la glace. Comptez et triez les femelles engorgées des moustiques non installés. Éliminer les moustiques non installés par immersion dans un tube conique de 50 mL rempli d’éthanol à 70 %. Pendant que les moustiques sont encore anesthésiés, remettez-les dans le carton de 0,5 L et recouvrez rapidement avec l’écran et le couvercle. Coupez l’excès de maille d’écran du carton et fixez la maille avec du ruban adhésif.</li>
	<li>Ajouter une boule de coton saturée de saccharose aqueux stérile filtré à 10% à l’écran de chaque carton. Placez tous les cartons anti-moustiques dans un grand récipient secondaire en plastique avec une éponge humide pour maintenir l’humidité.</li>
	<li>Placer le récipient secondaire contenant des cartons de moustiques dans un incubateur à une température de 27 ± 1 °C (ou, le cas échéant, pour simuler des conditions dans la région d’intérêt) avec une humidité relative de 80 % ± 10 % et un cycle lumière/obscurité de 16:8). Maintenir les moustiques avec un accès ad libitum à 10% de saccharose jusqu’à la fin des expériences.</li>
</ol>5. Acquisition et traitement des échantillons
<ol><li>Les jours spécifiés après l’alimentation, aspirer un nombre prédéterminé de moustiques des cartons appropriés à l’aide d’un aspirateur mécanique dans une boîte à gants. Coiffez le tube de collecte avec un rond de coton après l’acquisition du nombre requis de moustiques.</li>
	<li>Anesthésie à froid des moustiques par incubation pendant 30 secondes à -20 °C ou pendant 5 minutes à 4 °C.</li>
	<li>Dans la boîte à gants, versez les moustiques dans une boîte de Petri sur de la glace. À l’aide de deux paires de pinces, retirer les six pattes de chaque moustique et placer dans un tube de microcentrifuge à fond rond prémarqué de 2 mL contenant un roulement à billes en acier inoxydable stérilisé (7/32 po) et 500 μL de milieux de collecte de moustiques (MCM) composés de DMEM, de 2 % de FBS, de 1 % de pénicilline-streptomycine et de 2,5 μg/mL d’amphotéricine.</li>
	<li>Placez doucement le moustique sur une goutte d’huile minérale pour le retenir, en prenant soin de ne permettre aucun contact entre l’huile et la tête et la trompe du moustique.</li>
	<li>Insérez la trompe de moustique dans une pointe de pipette de 10 μL remplie de 10 μL de FBS inactivé par la chaleur. REMARQUE: Alternativement, la pipette peut être remplie de saccharose, de sang ou d’huile minérale. L’huile permet la visualisation directe des bulles de salive par microscopie optique.</li>
	<li>Laissez le moustique saliver pendant 30 min. Éjecter l’embout de la micropipette contenant fbS + salive dans un tube de microcentrifugation contenant 100 μL de MCM, puis placer la carcasse dans un tube de microcentrifugation à fond rond séparé de 2 mL contenant un roulement à billes en acier stérilisé et 500 μL de MCM. Assurez-vous que les tubes utilisés pour les corps, les jambes et la salive sont étiquetés de manière à ce qu’il soit clair que les trois échantillons proviennent du même moustique.</li>
	<li>Pendant que le ou les moustiques salivent, effectuez les étapes 5,3 à 5,5 sur les moustiques restants.</li>
	<li>Transporter les tubes contenant les corps et les jambes vers un dispositif d’homogénéisation tissulaire de broyage de billes contenu dans un ESB. Triturez tous les échantillons de corps et de jambes à 26 Hz pendant 5 minutes pour libérer les particules virales dans le surnageant. Clarifier tous les échantillons par centrifugation à 200 x g pendant 5 min pour granuler les débris cellulaires. REMARQUE: À ce stade, les échantillons peuvent être congelés à -80 ° C ou analysés immédiatement.</li>
</ol>6. Détection du ZIKV par essai infectieux
<ol><li>Dans un ESB, préparer 24 plaques de culture tissulaire de puits avec des cellules Vero(10 5 cellules par puits) 24 h avant le début du test infectieux. Étiquetez chaque puits avec l’identité d’un seul moustique/ échantillon.</li>
	<li>Si les échantillons ont été congelés à -80 °C, laisser décongeler.</li>
	<li>Retirez le média des plaques cellulaires Vero avant l’inoculation avec des échantillons une plaque à la fois.</li>
	<li>Pour les échantillons contenant des corps ou des jambes, aliquotez soigneusement 100 μL de surnageant clarifié dans chaque puits, en prenant soin de ne pas déranger les débris de cellules de moustiques de la pastille. REMARQUE: Les échantillons de salive peuvent être dilués 1: 1 (v / v) avec MCM avant l’inoculation sur les cellules pour conserver les échantillons pour un titrage ultérieur, si nécessaire.</li>
	<li>Déplacez les plaques dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 et incubez pendant 1 h.</li>
	<li>Retournez les plaques à l’ESB et ajoutez environ 1 mL de superposition de méthylcellulose à chaque puits. Replacez les plaques superposées dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 et incubez pendant 3 à 7 jours (en fonction du virus ou de la souche).</li>
	<li>Effectuez la fixation et la visualisation comme décrit aux étapes 3.6 à 3.9.</li>
	<li>En ce qui concerne la notation via un test de mise au point, quantifiez les puits positifs par un examen au microscope optique. La détection de la coloration intracytoplasmique des cellules dans un puits indique la présence d’un virus. Les échantillons sont notés uniquement comme étant positifs ou négatifs.</li>
</ol>

<ol>
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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+epidemiology+reveals+multiple+introductions+of+Zika+virus+into+the+United+States.">Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States.</a> Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).</li><li>Guerbois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Zika+Virus+Infection,+Chiapas+State,+Mexico,+2015,+and+First+Confirmed+Transmission+by+Aedes+aegyti+Mosquitoes+in+the+America.">Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).</li><li>Lundstrom, J. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonized+Sabethes+cyaneus,+a+Sylvatic+New+World+Mosquito+Species,+Shows+a+Low+Vector+Competence+for+Zika+Virus+Relative+to+Aedes+aegypti.">Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti.</a> Viruses. 10 (8), 434 (2018).</li><li>Roundy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+Aedes+aegypti+Mosquito+Competence+for+Zika+Virus+Transmission.">Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).</li><li>Wilson, A. J., Harrup, L. 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X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Feeding+Patterns+of+Mosquitoes+in+a+Rural+Malaria-Endemic+Region+in+Hainan+Island,+China.">Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).</li><li>Kuno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+history+of+laboratory+breeding+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+focusing+on+the+origins+and+use+of+selected+strains.">Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains.</a> Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).</li><li>Mayilsamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+Long+Viability+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+Eggs+Stored+Under+Normal+Room+Condition.">Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition.</a> Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).</li><li>Althouse, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+Zika+Virus+to+Establish+a+Sylvatic+Transmission+Cycle+in+the+Americas.">Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).</li><li>Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fever+from+the+forest:+prospects+for+the+continued+emergence+of+sylvatic+dengue+virus+and+its+impact+on+public+health.">Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).</li><li>Vasilakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+ancestral+sylvatic+dengue-2+viruses+to+re-emerge.">Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge.</a> Virology. 358 (2), 402-412 (2007).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les méthodes décrites ici fournissent un flux de travail généralisé pour effectuer des analyses de compétences vectorielles. En tant que cadre général, bon nombre de ces méthodologies sont conservées dans toute la littérature. Cependant, il y a une marge de manœuvre substantielle pour des modifications (examinées dans Azar et Weaver1). On sait que les virus (p. ex., lignée virale, entreposage du virus de provocation, antécédents de passage viral), l’entomologie (p. ex., colonisat...

La compétence vectorielle est définie comme la capacité au niveau de l’espèce, de la population, et même d’un individu, d’un arthropode donné tel qu’un moustique, une tique ou une phlébotomine, d’acquérir et de transmettre biologiquement un agent avec réplication ou développement chez l’arthropode1,2. En ce qui concerne les moustiques et les virus transmis par les arthropodes (c.-à-d. les arbovirus), l’agent est absorbé d’un hôte virémique par un moustique femelle. Après l’ingestion, le virus doit infecter de manière productive l’une des petites populations de cellules épithéliales de l’intestin moyen3,en surmontant divers obstacles physiologiques tels que la dégradation protéolytique par les enzymes digestives, la présence du microbiote (barrière d’infection de l’intestin moyen, ou MIB) et la matrice péritrophique sécrétée. L’infection de l’épithélium de l’intestin moyen doit être suivie d’une réplication du virus et d’une éventuelle fuite de l’intestin moyen dans le système circulatoire ouvert du moustique, ou hémolymphe, qui représente l’apparition d’une infection disséminée surmontant la barrière d’échappement de l’intestin moyen (MEB). À ce stade, le virus peut établir des infections de tissus secondaires (par exemple, les nerfs, les muscles et les corps gras) et continuer à se répliquer, bien qu’une telle réplication secondaire puisse ne pas être strictement nécessaire pour que le virus infecte les cellules acineuses des glandes salivaires (en surmontant la barrière d’infection des glandes salivaires). La sortie des cellules acineuses des glandes salivaires dans leurs cavités apicales, puis le mouvement dans le canal salivaire permettent l’inoculation du virus dans les hôtes ultérieurs lors de la morsure et complètent le cycle de transmission1,2,4,5,6,7.
Compte tenu de ce mécanisme de propagation bien caractérisé et généralement conservé au sein d’un moustique vecteur, les évaluations des compétences des vecteurs de laboratoire sont souvent méthodologiquement similaires, bien qu’il existe des différences dans les protocoles1,2. Généralement, après une exposition au virus oral, les moustiques sont disséqués de sorte que les tissus individuels tels que l’intestin moyen, les jambes, les ovaires ou les glandes salivaires peuvent être testés pour l’infection virale, l’infection disséminée, l’infection disséminée / transmission transovarienne potentielle et l’infection disséminée / la compétence de transmission potentielle, respectivement8. La simple présence d’un virus dans les glandes salivaires, cependant, n’est pas une preuve définitive de la capacité de transmission, étant donné la preuve d’une barrière d’échappement/ sortie des glandes salivaires (SGEB) dans certaines combinaisons vecteur/virus1,2,4,5,7,9. La méthode standard pour prouver la compétence de transmission reste la transmission par les moustiques à un animal sensible10,11,12. Cependant, étant donné que pour de nombreux arbovirus, cela nécessite l’utilisation de modèles murins immunodéprimés13,14,15,16, cette méthode est souvent prohibitive. Une alternative couramment utilisée est la collecte de la salive du moustique, qui peut être analysée par réaction en chaîne par transcription inverse-polymérase (RT-PCR) ou un test infectieux pour démontrer la présence du génome viral ou de particules infectieuses, respectivement. Il convient de noter que de telles méthodes de collecte de salive in vitro peuvent surestimer12 ou sous-estimer17 la quantité de virus déposée lors de l’alimentation in vivo, ce qui indique que ces données doivent être interprétées avec prudence. Néanmoins, la méthode in vitro est très précieuse lorsqu’elle est analysée du point de vue de la simple présence de virus dans la salive, indiquant un potentiel de transmission.
Deux approches majeures existent pour déterminer le rôle des moustiques vecteurs dans les épidémies de maladies arbovirales. La première méthode implique une surveillance sur le terrain, dans laquelle les moustiques sont collectés dans le cadre de la transmission active18,19,20,21,22,23,24. Cependant, étant donné que les taux d’infection sont généralement assez faibles (p. ex., le taux d’infection estimé à 0,061 % des moustiques dans les zones de circulation active du virus Zika (ZIKV) aux États-Unis21), l’incrimination des espèces vecteurs potentielles peut être fortement biaisée par la méthode de piégeage25,26 et le hasard aléatoire (p. ex., échantillonnage d’une personne infectée sur 1 600 non infectées)21 . Compte tenu de cela, une étude donnée peut ne pas acquérir suffisamment de moustiques en nombre brut ou en diversité d’espèces pour échantillonner avec précision les moustiques impliqués dans la transmission. En revanche, les analyses de compétence vectorielle sont effectuées en laboratoire, ce qui permet un contrôle strict de paramètres tels que la dose orale. Bien qu’elles ne soient pas entièrement capables de représenter la véritable complexité de l’infection par les moustiques et de la capacité de transmission sur le terrain, ces évaluations en laboratoire demeurent des outils puissants dans le domaine de l’arbovirologie.
Sur la base de diverses analyses de compétence vectorielle avec ZIKV chez plusieurs espèces, populations et méthodes de moustiques27,28,29,30,31,32, ainsi que d’un examen récent des évaluations de compétence vectorielle1, nous décrivons ici plusieurs des protocoles associés à un flux de travail de compétence vectorielle typique. Dans ces expériences, trois populations d’Ae. aegypti des Amériques (la ville de Salvador, Brésil; République dominicaine; et la basse vallée du Rio Grande, TX, États-Unis) ont été exposées à une seule souche de ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) à des doses de 4, 5 ou 6 log10 unités focalisantes (FFU) / mL au moyen de farines de sang artificielles. Par la suite, ils ont été analysés pour détecter des signes d’infection, d’infection disséminée et de compétence en matière de transmission après diverses périodes d’incubation extrinsèque (2, 4, 7, 10 et 14 jours) au moyen d’une dissection et d’un test infectieux basé sur la culture cellulaire. Bien que le flux de travail et les protocoles actuels soient optimisés pour le ZIKV, de nombreux éléments sont directement transposables à d’autres arbovirus transmis par les moustiques dans les niveaux de confinement et de biosécurité des arthropodes 2 et 3 (ACL/BSL2 ou ACL/BSL3).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3mL Standard Reservoir</td>
			<td>R37P30</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7/32&#34; Stainless Steel 440 Grade C Balls</td>
			<td>4RJH9</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>Grinding Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case</td>
			<td>A16-P4</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture</td>
			<td>A6419-1G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Primary Antibody for focus forming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle</td>
			<td>5450-0011</td>
			<td>KPL/Seracare</td>
			<td>Secondary Antibody for focus forming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>NC0427256</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Decontamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50</td>
			<td>10-126-34</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning</td>
			<td>07-200-91</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>C0775-100G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case</td>
			<td>05-402-7</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case</td>
			<td>13-675-20</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case</td>
			<td>13-675-15B</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case</td>
			<td>13-675-30</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case</td>
			<td>13-675-22</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td>08-772B</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL</td>
			<td>S11150</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Immobilization of Mosquitos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FU1 Feeder</td>
			<td>FU1-0</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment; feeding units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles</td>
			<td>140-040-182</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250&#956;g/mL, 50mL/Bottle</td>
			<td>15-290-026</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case</td>
			<td>15-140-163</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles</td>
			<td>25-200-114</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles</td>
			<td>11-965-118</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit</td>
			<td>7203706</td>
			<td>Lampire</td>
			<td>Bloodmeal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InsectaVac Aspirator</td>
			<td>2809B</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case</td>
			<td>A412-4</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 &#176;C), 250g/Bottle</td>
			<td>M0512-250G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-chem Plus Disinfectant Detergent</td>
			<td>C849T34</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology</td>
			<td>M5904-5X5ML</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Immobilization of Mosquitos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>OR37-25</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Plugs</td>
			<td>PP5-250</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS6 Power Unit (110-120V)</td>
			<td>PS6120</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment; power source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubis Forceps, Offset blades, superfine points</td>
			<td>4525</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case</td>
			<td>50-809-242</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, BioUltra, for molecular biology</td>
			<td>84097-250G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000&#956;L Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case</td>
			<td>21-402-487</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200&#956;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td>
			<td>21-402-486</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20&#956;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td>
			<td>21-402-484</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10&#956;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td>
			<td>21-402-482</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>85300</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>Homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL</td>
			<td>5510-0030</td>
			<td>Seracare</td>
			<td>Developing solution for focus forming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6]</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td>
		</tr>
	</tbody>
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vector competence analyses on aedes aegypti mosquitoes using zika virus

Les procédures présentées décrivent une méthodologie généralisée pour infecter les moustiques Aedes aegypti avec le virus Zika dans des conditions de laboratoire afin de déterminer le taux d’infection, d’infection disséminée et de transmission potentielle du virus dans la population de moustiques en question. Ces procédures sont largement utilisées avec diverses modifications dans les évaluations des compétences vectorielles à l’échelle mondiale. Ils sont importants pour déterminer le rôle potentiel qu’un moustique donné (c.-à-d. espèce, population, individu) peut jouer dans la transmission d’un agent donné.

Trois populations d’Ae. aegypti des Amériques (Salvador, Brésil; République dominicaine; et la vallée du Rio Grande, TX, États-Unis) ont été exposées à une souche épidémique de ZIKV des Amériques (ZIKV Mex 1-7, État du Chiapas, Mexique, 2015) sur une gamme de titres de farine de sang (4, 5 et 6 log10 FFU / mL) présentés dans une farine de sang artificielle à base d’érythrocytes humains lavés. Aux jours 2, 4, 7, 10 et 14 après l’infection, des sous-ensembles de moustiques ont ?...

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Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Le protocole présenté peut déterminer la compétence vectorielle des populations de moustiques Aedes aegypti pour un virus donné, tel que Zika, dans un contexte de confinement.

Analyses de compétence vectorielle sur les moustiques Aedes aegypti utilisant le virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

2.8K vues.  University of Texas Medical Branch. Le protocole présenté peut déterminer la compétence vectorielle des populations de moustiques Aedes aegypti pour un virus donné, tel que Zika, dans un contexte de confinement.

Vidéo: Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

Un test de bioluminescence calcium pour l&#39;analyse fonctionnelle des moustiques ( Aedes aegypti) Et cochez (<emRhipicephalus> microplus) G récepteurs couplés aux protéines

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Recherche

Immunologie et infection

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Un protocole pour le recueil et la coloration hémocytes du moustique Fièvre jaune Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

La détection de virus infectieux à partir terrain recueillies par les moustiques Assay culture cellulaire Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Hybridation<em&gt; In situ</em&gt; Des glandes salivaires, des ovaires et des embryons de moustiques vecteurs

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika Virus système infectieuse Culture cellulaire et la<em&gt; In vitro</em&gt; Effet prophylactique des interférons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Le sauvetage et la caractérisation du virus recombinant à partir d&#39;un nouveau clone infectieux du virus Zika du monde

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

Zika Virus spécifique Diagnostic épitope découverte

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

Un Simple écoulement Cytometry Based Assay pour déterminer In Vitro anticorps dépendant amélioration du Virus de la Dengue à l’aide de sérum de Convalescent Virus Zika

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

Quantification de l’amélioration dépendante des anticorps du Virus dans les cellules humaines primaires Zika

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

Sauvetage du virus Zika recombinant d'un clone d'ADNc chromosomique artificiel bactérien

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...