Cette méthode peut être utilisée pour évaluer les effets de l’immunité préexistant contre le virus dengue sur l’infection par le virus Zika, à l’aide du sérum humain réel et des cellules immunitaires humaines primaires. L’utilisation d’échantillons réels de sérum humain et de cellules primaires humaines donne un aperçu plus approfondi de l’amélioration dépendante des anticorps du virus Zika par le sera préimmunisé et les anticorps. Cette méthode donne un aperçu de la capacité des anticorps dans le sang d’un patient à améliorer une infection virale dans d’autres cellules humaines.
Il est important de s’assurer que les niveaux d’infection virale sont suffisamment élevés pour être détectés, mais suffisamment bas pour ne pas submerger les cellules ou interférer avec l’interprétation des données. Commencez par ensemencement trois fois dix à la quatrième cellule dans 100 microlitres de milieu de culture cellulaire par puits dans une plaque stérile et plate de 96 puits. Lorsque toutes les cellules ont été plaquées, placez la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius et de 5 % de dioxyde de carbone et faites 10 dilutions périodiques d’échantillons de sérum humain décongelés dans un milieu sans sérum.
Assurez-vous de garder les dilutions sériques et le facteur de dilution constants pour tous les sérums préimmuns avant d’ajouter les dilutions aux solutions virales et aux cellules. Ensuite, le virus Zika dégele la solution de stock dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant une à deux minutes avant de transférer rapidement le stock sur la glace. Ajouter une multiplicité de 0,1 volume équivalent d’infection du virus Zika aux aliquots sériques et placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant une heure pour permettre aux anticorps contre le virus de la dengue de former des complexes avec les virions Zika.
À la fin de l’incubation, laver les cellules avec 100 microlitres de PBS par puits et ajouter 50 microlitres de complexe immunitaire à chaque puits. Après l’incubation de deux heures, retirer le milieu et laver les puits deux fois avec 100 microlitres de PBS par puits pour enlever complètement les complexes immunitaires et les virions non attachées. Puis nourrir les cellules avec 100 microlitres par puits de culture cellulaire moyen complété par 10% sérum bovin fœtal.
Retournez ensuite les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant 48 heures. Deux jours après l’infection, lavez les cellules deux fois avec 100 microlitres de PBS stérile par puits avant d’ajouter 250 microlitres de tampon de lyse cellulaire avec 10% de mercaptoéthanol bêta à chaque puits. Pipette de haut en bas au moins cinq fois avec des rayures pour accélérer le processus de lyse et de transférer les lysates cellulaires à stérile étiquetés tubes de 1,5 millilitre.
Ajoutez un volume égal de 70% d’éthanol à chaque tube et pipette la solution lysate de haut en bas quatre à cinq fois. Lorsque les suspensions lysate sont claires, transférez chaque solution dans des colonnes à base de silice étiquetées dans deux tubes de collecte millilitres pour centrifugation. Jetez le flow-through en gardant les colonnes dans les mêmes tubes de collecte et ajoutez 700 microlitres de Wash Buffer 1 à chaque colonne pour une deuxième centrifugation.
Après avoir jeté le flow-through, rincer les colonnes deux fois de plus avec 500 microlitres de Wash Buffer deux par lavage. Après le deuxième lavage, transférer les colonnes dans de nouveaux tubes de collecte de deux millilitres pour une autre centrifugation. Ajouter 30 microlitres d’eau sans RNase de 42 degrés Celsius au centre de chaque colonne pour la centrifugation et récupérer l’ARN éduqué.
Pour la réaction quantitative en temps réel de chaîne de polymése ou l’analyse de QRTPCR ajoutent un microlitre des amorces avant et inverse spécifiques de gène de 10 stocks de micromolaire avec 0.25 microlitres du mélange inverse de transcriptase par réaction. Notez que les amorces qui reconnaissent le matériel génétique du virus Zika détecteront les gènes viraux et permettront la quantification des infections. Ensuite, ajoutez 12,5 microlitres de SYBR Green Mix suivis de 25 microlitres d’eau à chaque réaction en ajoutant 15 microlitres de Master Mix dans chaque puits de plaque QPCR de 96 puits.
Lors de l’utilisation d’un Master Mix, ajouter 100 nanogrammes de l’échantillon d’ARN au mélange et pipette le Master Mix dans les puits individuels de la plaque QRTPCR. Notez que les échantillons doivent être exécutés en triplicate sur la même plaque QRTPCR. Ensuite, exécutez les échantillons sur une machine PCR quantitative en fonction des paramètres décrits dans le tableau.
En cliquant sur l’onglet courbe de fusion dans le logiciel du système pour surveiller la courbe de fusion. La courbe de fonte affichera un pic unique dans tous les échantillons pour qu’un gène particulier confirme la présence d’un seul amplicon. Pour obtenir des résultats optimaux, utilisez des incréments de température de 0,5 degré Celsius entre les étapes et un temps de détention minimum de 10 secondes dans le protocole de la courbe de fusion.
Cliquez ensuite sur l’onglet données de quantification pour obtenir un cycle quantitatif pour chaque échantillon et exporter les données vers une feuille de calcul pour une analyse de quantification plus poussée. Les échantillons de sérum humain peuvent être classés en trois groupes différents : l’infection par le virus de la dengue a confirmé des échantillons, les échantillons confirmés d’anticorps du virus de la dengue et le sera sain sans anticorps neutralisant le virus de la dengue ou arn. Après 48 heures d’infection, l’analyse QRTPCR démontre que la plupart des sérotypes du virus de la dengue d’un à quatre sont capables d’améliorer la réplication du virus Zika à différents niveaux.
L’augmentation la plus forte du nombre de titres du virus Zika se trouve dans les macrophages traités par le virus de la dengue contenant du sérotype deux et quatre anticorps par rapport au sérotype un et trois qui montrent une induction relativement plus faible du virus Zika. Il est important de maintenir un environnement stérile, de porter l’équipement de protection personnelle approprié, et de toujours garder les échantillons de sérum de virus décongelés et les reagents QPCR sur la glace. Ce protocole peut facilement être modifié pour étudier l’amélioration dépendante des anticorps d’autres flavivirus tels que le virus de la fièvre jaune, le virus de la dengue ou le virus du Nil occidental à l’aide d’un panneau de sérum patient.
Cette technique sera très utile pour mener à bien de futures études d’amélioration dépendantes des anticorps dans les domaines de l’arbovirus ou de la virologie. Un équipement de protection individuelle de niveau de biosécurité approprié deux doit être utilisé en tout temps et tous les déchets viraux doivent être décontaminés dans 10 % d’eau de Javel pendant 30 minutes avant l’élimination.
