Nous tenons à souligner la contribution importante des Drs. John Anderson, Andrew Main et Shirley Tirrell à cette étude. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) et le US Department of Agriculture (58-6615-1-218, CONH00768 et CONH00773).

1. Le tri et l&#39;identification des moustiques <ol><li> Les procédures suivantes sont effectuées sur un banc dans un laboratoire ouvert dédié biosécurité de niveau 2 (BSL-2) en laboratoire par du personnel qui sont formés pour travailler avec les moustiques vivent. Une &quot;chaîne du froid» est maintenu pendant toute la procédure. </li><li> Anesthetize vivent les moustiques adultes en plaçant sac de collecte de moustiques dans un congélateur -20 ° C pendant 5 minutes. Sac de collecte de transfert d&#39;un conteneur isotherme contenant de la glace sèche. Fermer le couvercle et exposer les moustiques au dioxyde de carbone pendant 1-3 minutes pour assurer complète le knock-down. </li><li> Tap moustiques anesthésiés sur un pan de pré-réfrigérée placé sur un lit de glace sèche. Individuelle séparée moustiques femelles à l&#39;aide de pinces fines et placez dans des gobelets en partie en plastique. Couvrez avec le couvercle et gobelets place sur la glace mouillée. </li><li> Identifier les moustiques des espèces en utilisant des clés taxonomiques descriptive basée sur la morphologie externe des moustiques à l&#39;aide d&#39;un microscope stéréo dissection (10-60X zoom) monté sur une table de réfrigérer électronique. </li><li> Combinez identifié les espèces de moustiques dans les piscines de ≤ 50 personnes dans 2 mL snap-bouchon des flacons contenant un BB de cuivre. Les flacons sont étiquetés avec un identifiant unique. </li><li> Après identification de tous les moustiques, les flacons sont placés dans des sacs étiquetés et stockés dans un refroidisseur styromousse contenant de la glace sèche. </li><li> Magasin de pools de moustiques dans un congélateur à -80 ° C jusqu&#39;à ce que les tests de virus. </li></ol> 2. Considérations de biosécurité afin d&#39;isoler le virus par les moustiques <ol><li> Les procédures suivantes sont effectuées dans une biosécurité de niveau 3 (BSL-3) en laboratoire par du personnel qui sont formés pour travailler à ce niveau de confinement 1. Les équipements de laboratoire, les équipements, les procédures et les pratiques sont soumises à la surveillance institutionnelle, étatique et fédéral et d&#39;inspection. Cherchez la formation appropriée et l&#39;approbation avant de tenter les protocoles suivants. </li><li> Porter l&#39;équipement approprié de protection individuelle (EPI) pour chaque procédure telles que des blouses jetables, gants, visières et des respirateurs. </li><li> Désinfectez les surfaces de travail avec de l&#39;alcool 70% avant et après l&#39;achèvement des procédures. </li><li> Les cultures cellulaires et de matériel potentiellement infectieux sont traitées dans une armoire de biosécurité de classe II (CSB). </li><li> Pools de moustiques sont homogénéisés dans un mélangeur-broyeur qui est placé à l&#39;intérieur d&#39;un BSC. </li><li> Mosquito homogénats sont centrifugés dans une microcentrifugeuse étanche aux aérosols. Si cette procédure ne peut être effectuée au sein d&#39;un BSC, l&#39;opérateur doit porter un respirateur lors de l&#39;utilisation et la récupération des échantillons provenant de la centrifugeuse. </li><li> Pipettes et embouts de pipettes de manutention dans le BSC (enceinte de sécurité biologique) sont trempées dans l&#39;eau de Javel à 10% avant l&#39;autoclavage. Tous les déchets de laboratoire est décontaminé par autoclavage avant leur élimination. </li></ol> 3. Préparation des cellules Vero <ol><li> Décanter les milieux de culture d&#39;un flacon de culture de tissus de grande taille (175 cm 2) de confluence des cellules Vero (Clone E6) dans un bécher de déchets contenant du javellisant. </li><li> Laver les cellules Vero en ajoutant une aliquote de 5 ml de PBS et agiter sur la couche de cellules et le long des côtés flacon en prenant soin de bien couvrir l&#39;ensemble monocouche. </li><li> Décanter PBS dans un bécher de déchets. </li><li> Ajouter 2,5 ml de trypsine-EDTA et tourbillonner sur la couche de cellules en prenant soin de bien couvrir l&#39;ensemble monocouche. </li><li> Incuber flacon dans l&#39;incubateur pendant 5 minutes à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Agitez doucement et le flacon tourbillonner pour éliminer les cellules de la surface inférieure. Les cellules doivent glisser facilement; incuber 1-5 minutes supplémentaires si les cellules ne sont pas facilement glisser. </li><li> Ajouter 5 ml de milieu minimum essentiel (MEM), 5% de sérum fœtal bovin (FBS), en utilisant une pipette sérologique et pipette up-and-down 10-20 fois pour briser les amas de cellules. </li><li> Ajouter un supplément de 15 ml MEM, 5% de FBS pour un volume total de 22,5 ml et bien mélanger. </li><li> Placer 40 petits flacons de culture tissulaire (25 cm 2) en position verticale dans deux racks (20 flacons / rack). </li><li> Placez les supports contenant des flacons dans l&#39;armoire de biosécurité et enlever les bouchons ballon, plaçant directement en face bouchons des flacons. </li><li> Distribuer 4 ml de MEM, FBS 5% dans chaque flacon à l&#39;aide d&#39;une pipette sérologique. </li><li> Distribuer 0,5 mL cellules en suspension dans chaque flacon (rapport ~ fractionnement 01:06) Remplacer bouchons flacon. </li><li> Ajouter 50 ml de MEM, 5% de FBS à la fiole d&#39;origine tissulaire grande culture contenant les cellules en suspension restantes (~ 2,5 ml) et le retour ballon à l&#39;incubateur. Le même grand flacon de culture de tissus peuvent être réutilisés jusqu&#39;à 5 passages et puis un nouveau flacon doit être mis en place pour le remplacer. </li><li> Placer la culture de tissus de petites fioles en piles sur le plateau. Agiter le plateau pour faire en sorte que les médias couvre uniformément le fond de la Flaks. </li><li> Placez de petits flacons dans l&#39;incubateur à 37 ° C, 5% de CO 2 et de croître durant la nuit jusqu&#39;à confluence de 80-90%. </li></ol> 4. Préparation des pools de moustiques <ol><li> Gardez pools de moustiques froid pendant les procédures de tests. Utilisez pré-réfrigéréeracks congélateur et mélangeur-broyeur à cassettes, glacée réactifs, et d&#39;une centrifugeuse réfrigérée lors du traitement de pools de moustiques. </li><li> Placer les tubes contenant les moustiques dans un rack de pré-congélateur refroidi et ajouter 1 - 1,5 ml de PBS-G pour chaque tube de moustiques. </li><li> Récupérer mélangeur-broyeur à cassettes dans le congélateur. Place 24 tubes dans chaque cassette et ensuite sécurisé dans le mélangeur-broyeur. </li><li> Homogénéiser les échantillons pendant 4 minutes à 25 cycles / seconde. Le moulin mélangeur secoue les tubes à haute vitesse et un BB métal à l&#39;intérieur de chaque tube perturbe le tissu de moustique. </li><li> Centrifuger les tubes pendant 6 minutes à 7000 rpm. </li><li> Placer les tubes de retour dans des racks congélateur jusqu&#39;à inoculés dans des cellules Vero. </li></ol> 5. L&#39;inoculation de cellules Vero avec des broyats de moustiques <ol><li> Vérifiez au moins un flacon de culture tissulaire de chaque série de sous microscope inversé pour assurer santé adéquats confluence et de cellules; attendent sur la couverture de 80-90%. </li><li> Line up 20 petits flacons de culture tissulaire dans un rack et des flacons d&#39;étiquettes avec des numéros d&#39;adhésion correspondants de chaque pool de moustiques. </li><li> Desserrez bouchons et la plupart des médias décanter des flacons de culture de tissu dans un bécher de déchets. Laisser suffisamment de médias dans le ballon complètement monocouche cellulaire manteau. </li><li> 100 ul aliquote de surnageant de chaque groupe de moustiques traitées dans le flacon de culture tissulaire correspondant. </li><li> Remplacer et serrer le bouchon flacon de culture. </li><li> Lay flacons de culture à plat sur agitateur pendant 5 minutes (température ambiante) à 35-40 min. </li><li> Retour 20 flacons de culture tissulaire à la position verticale dans un rack et le placer dans le BSC. </li><li> Désoperculer 3 flacons de culture tissulaire à un moment, passer quatre milieux de croissance ml dans chaque flacon à l&#39;aide d&#39;une pipette sérologique; remplacer les bouchons. </li><li> Soyez sûr que la pointe de la pipette ne touche pas le col du flacon de culture ou de la lèvre. Changement des embouts de pipette comme nécessaire si le contact est fait avec le ballon. </li><li> Incuber flacons de culture tissulaire à 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 6. Dépistage des cellules Vero pour la croissance du virus <ol><li> Ecran inoculé flacons de culture tissulaire pour des signes d&#39;infection virale, l&#39;effet cytopathogène (ECP), à partir de 3-7 jours après l&#39;inoculation. </li><li> Inspectez les cultures de cellules pour les CPE et / ou de contamination en inclinant les flacons et en examinant les médias que les piscines au fond du flacon. Le support apparaît trouble que les cellules se détériorent au cours CPE ou en raison de la croissance de la levure, champignon, ou une contamination bactérienne. </li><li> Réexaminer les cultures de cellules qui présentent des médias trouble sous un microscope inversé. Virus sera amener les cellules à se déformer et se détacher de l&#39;flacons de culture. Les cultures cellulaires avec des contaminants visibles, la levure, par exemple, d&#39;autres bactéries, des champignons ou des débris de moustiques lourds, sont re-testé en passant de la piscine de moustique d&#39;origine à travers un filtre seringue 0.22μM. </li><li> Aseptiquement passer 1-2 PG de médias de virus positifs des cultures cellulaires dans des cryotubes étiquetés à l&#39;aide d&#39;une pipette sérologique. </li><li> Cultures de virus sont conservés à -80 ° C jusqu&#39;à identifiés en utilisant les tests diagnostiques appropriés. </li></ol> 7. Préparation des réactifs <ol><li> MEM, 5% de FBS. Dissoudre 37,6 g de poudre dans du MEM un volume final de 4 L de dd H 2 0. Répartir la solution dans 500 ml aliquotes dans des bouteilles de médias et de l&#39;autoclave. Lorsque la solution est refroidie, ajouter aseptiquement 26 inactivée par la chaleur ml de sérum de veau fœtal, 5,2 ml de L-glutamine, 5,2 ml anti-biotic/mycotic, et 10,4 ml de bicarbonate de sodium 7,5% à chaque bouteille. Conserver à 4 ° C. </li><li> PBS-G. Dissoudre 16 g de NaCl, 0,4 g de KCl, 2,3 g de Na 2 HPO 4, 0,4 g de KH 2 PO 4, et 4 ml de rouge de phénol à 0,5% en 1000 ml de H 2 0 dd. Ajuster le pH à 7.1-7.4 avec NaOH 2 N (si nécessaire). Dans un bécher séparé, la chaleur de 600 mL de H 2 0 à ébullition. Retirer de la plaque chaude, ajoutez 10 g de gélatine, et se dissolvent. Ajouter une solution de gélatine dissoute à la solution PBS et ajuster le volume final à 2 L avec dd H 2 O. Distribuer 100 ml de solution dans des bouteilles et autoclave. Lorsque la solution est refroidie, ajouter aseptiquement 42,8 ml de sérum de lapin inactivé à la chaleur et de 1,4 ml anti-biotic/mycotic. Conserver à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules du PBS. Ajouter 50 ml 10X PBS de Dulbecco à 400 mL jj H 2 O. Ajuster le pH à 7,1 avec NaOH 2N. Ajuster le volume final à 500 ml avec dd H 2 O. Solution de filtre avec filtre aspirateur 0.2uM. Répartir dans des aliquotes de 5 ml dans 8 ml à bouchon à vis des tubes. Conserver à 4 ° C. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs Neuf différents de virus à partir de 4 familles taxonomiques ont été récupérés par les moustiques recueillis lors de la surveillance en continu tout l&#39;État du Connecticut de 1997 à 2010 (tableau 1). Cinq de ces virus sont connus pour provoquer une maladie humaine, les pathogènes les plus importants étant le virus West Nile et le virus de l&#39;encéphalite équine. De nouvelles découvertes incluent: le premier isolement du VNO par les moustiques collectés dansAmérique du Nord en 1999 2, le premier isolement du virus de Potosi, dans le nord des États-Unis en 2000 3, et le premier isolement du virus de La Crosse en Nouvelle-Angleterre en 2005 4. <table border="1"><tbody><tr><td> Virus </td><td> Famille </td><td> N ° isole </td><td> Lieux n ° </td><td> Année n ° détecté </td><td> Maladie de l&#39;homme </td><td> Refs. </td></tr><tr><td> Virus du Nil occidental </td><td> Flaviviridae </td><td> 1002 </td><td> 94 </td><td> 12 </td><td> Modérée à sévère, une fièvre, une encéphalite </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Le virus de l&#39;encéphalite équine orientale </td><td> Togaviridae </td><td> 292 </td><td> 41 </td><td> 10 </td><td> Sévère, l&#39;encéphalite </td><td> 6,7 </td></tr><tr><td> Highlands J virus </td><td> Togaviridae </td><td> 178 </td><td> 39 </td><td> 11 </td><td> Non connue </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Jamestown Canyon du virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 305 </td><td> 74 </td><td> 14 </td><td> Légère à modérée, la fièvre, la méningite </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Virus de Potosi </td><td> Bunyaviridae </td><td> 259 </td><td> 76 </td><td> 4 </td><td> Non connue </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Virus de la Cache Valley </td><td> Bunyaviridae </td><td> 114 </td><td> 51 </td><td> 8 </td><td> Légère à sévère, une fièvre, une maladie neurologique, dans deux cas documentés </td><td></td></tr><tr><td> Trivittatus virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 83 </td><td> 21 </td><td> 11 </td><td> Non connue </td><td></td></tr><tr><td> La Crosse virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> Modérée à sévère, une encéphalite </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Flandres de virus </td><td> Rhabdoviridae </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> Non connue </td><td></td></tr></tbody></table> Virus Tableau 1. Détecté dans le champ-moustiques recueillis par un test de culture de cellules Vero. Les moustiques ont été recueillies durant la surveillance tout l&#39;État du Connecticut de 1997 à 2010.

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	<li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2007).</li><li>Anderson, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+West+Nile+virus+from+mosquitoes,+crows,+and+a+Cooper's+hawk+in+Connecticut.">Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut.</a> Science. 286, 2331-2333 (1999).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolations+of+Potosi+virus+from+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+collected+in+Connecticut.">Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut.</a> J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+genetic+variant+of+La+Crosse+virus+(Bunyaviridae)+isolated+from+New+England.">A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England.</a> Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+West+Nile+virus+in+Connecticut,+USA:+a+five+year+analysis+of+mosquito+data+1999-2003.">Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+isolations+of+eastern+equine+encephalitis+and+highlands+J+viruses+from+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+during+a+1996+epizootic+in+southeastern+Connecticut.">Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut.</a> J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eastern+equine+encephalitis+virus+in+mosquitoes+and+their+role+as+bridge+vectors.">Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors.</a> Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolations+of+Jamestown+Canyon+virus+(Bunyaviridae:+Orthobunyavirus)+from+field-collected+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+in+Connecticut,+USA:+a+ten-year+analysis,+1997-2006.">Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).</li><li>Beaty, B. J., Calisher, C. H., Shope, R., Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11.">Chapter 11.</a> Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , 189-212 (1995).</li><li>Karabatsos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , (1985).</li><li>Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+west+nile+virus+from+human+clinical+specimens,+field-collected+mosquitoes,+and+avian+samples+by+a+TaqMan+reverse+transcriptase-PCR+assay.">Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay.</a> J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).</li><li>Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+North+American+eastern+and+western+equine+encephalitis+viruses+by+nucleic+acid+amplification+assays.">Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays.</a> J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).</li></ol>

Dosage de la culture de cellules Vero sert comme une méthode efficace pour les moustiques écran prélevés sur le terrain pour une diversité des virus. Cela contraste avec les méthodes moléculaires qui ciblent spécifiquement une ou quelques virus d&#39;intérêt. Par ailleurs, nous avons constaté que Vero essai de culture de cellules est tout autant, sinon plus sensible que la RT-PCR 7 et nous fournit des isolats de virus qui sont stockés dans notre collection de référence pour de futures études. N...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom de réactif / équipements </th><th> Société </th><th> Nombre de catalogue </th></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Anti-biotic/mycotic </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15240 </td></tr><tr><td> Le bicarbonate de sodium NaHCO 3, sol. 7,5%. </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-Glutamine 200 mM 100x </td><td> Invitrogen Gibco- </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> Poudre milieu minimum essentiel (MEM) </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 11700 </td></tr><tr><td> 10X PBS Dulbecco </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 14080 </td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> Sérum de lapin </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16120 </td></tr><tr><td> Cellules Vero (Clone E6) </td><td> ATCC </td><td> LCR-1586 </td></tr><tr><td> Petits flacons de culture tissulaire, capuchons ventilés, 25 cm 2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353112 </td></tr><tr><td> Grand flacons de culture tissulaire, capuchons ventilés, 175 cm 2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> Enduits de cuivre de BB, de 4,5 mm </td><td> Crosman </td><td> 0767 </td></tr><tr><td> Mixer Mill </td><td> Retsch </td><td> MM300 </td></tr><tr><td> Racks congélateur ISOPACK </td><td> Eppendorf </td><td> 022510240 </td></tr></tbody></table>

detection of infectious virus from field-collected mosquitoes by vero cell culture assay

Les moustiques transmettent un certain nombre de virus distincts, y compris d&#39;importants agents pathogènes humains tels que le virus West Nile, virus de la dengue et le virus chickungunya. Beaucoup de ces virus se sont intensifiées dans leurs gammes endémiques et élargi à de nouveaux territoires, ce qui nécessite des programmes efficaces de surveillance et de contrôle pour répondre à ces menaces. Une stratégie pour surveiller l&#39;activité des virus consiste à recueillir un grand nombre de moustiques à partir de sites endémiques et les tests d&#39;infection virale. Dans cet article, nous décrivons comment manipuler, traiter, et d&#39;un écran prélevés sur le terrain pour les moustiques virus infectieux par un test de culture cellulaire Vero. Les moustiques sont triés par emplacement des pièges et des espèces, et regroupés en pools contenant ≤ 50 individus. Pooled spécimens sont homogénéisés dans une solution saline tamponnée en utilisant un mélangeur-broyeur et la phase aqueuse est inoculé à des confluents des cultures de cellules Vero (Clone E6). Les cultures cellulaires sont surveillés pour effet cytopathique de jours 3-7 après l&#39;inoculation des virus et des mises en culture cellulaire sont identifiés par les tests de diagnostic appropriés. En utilisant cette approche, nous avons isolé 9 virus différent de moustiques collectés dans le Connecticut, USA, et parmi eux, 5 sont connus pour causer la maladie humaine. Trois de ces virus (virus du Nil occidental, le virus de Potosi et La Crosse virus) représentent de nouveaux records pour l&#39;Amérique du Nord ou la région de la Nouvelle-Angleterre depuis 1999. La capacité de détecter une grande diversité de virus est essentielle à la surveillance établis et les nouveaux virus émergents dans la population de moustiques.

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Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Nous décrivons une méthode pour traiter et d&#39;un écran moustiques récoltés sur le terrain pour une diversité des virus par un test de culture de cellules Vero. En employant cette technique, nous avons détecté 9 virus différents de 4 familles taxonomiques dans les moustiques collectés dans le Connecticut.

La détection de virus infectieux à partir terrain recueillies par les moustiques Assay culture cellulaire Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.3K vues.  The Connecticut Agricultural Experiment Station. Nous décrivons une méthode pour traiter et d'un écran moustiques récoltés sur le terrain pour une diversité des virus par un test de culture de cellules Vero. En employant cette technique, nous avons détecté 9 virus différents de 4 familles taxonomiques dans les moustiques collectés dans le Connecticut.

Vidéo: Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Imagerie de cellules vivantes de Alphaherpes Virus Transport antérograde et la propagation

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Recherche

Immunologie et infection

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organoïdes de modèle pour les maladies infectieuses: la culture des droits humains et murins organoïdes d&#39;estomac et microinjection de Helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika Virus système infectieuse Culture cellulaire et la<em&gt; In vitro</em&gt; Effet prophylactique des interférons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Le sauvetage et la caractérisation du virus recombinant à partir d&#39;un nouveau clone infectieux du virus Zika du monde

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Extraction rapide, sûre et Simple acide nucléique chevet manuelle pour la détection des Virus dans des échantillons de sang total

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Un modèle de Culture primaire de cellules bursite de poulet Ex Vivo pour étudier la bursite infectieuse Virus pathogenèse

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

Identification des souris et des répertoires d’anticorps humain par séquençage de prochaine génération

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay (CBA) is a widely used method to detect anti-AQP4 IgG in human serum with high sensitivity and specificity. Briefly, serum anti-AQP4 IgG is captured by AQP4-transfected cell that is fixed on the biochip then detected by a fluorescein-labelled secondary antibody. Fluorescence microscopy is utilized to visualize the fluorescence, and the intensity of fluorescence is evaluated by at least two experienced clinicians. A final diagnosis of NMOSD can be made based on the combination of anti-AQP4 IgG detection results, clinical manifestations, and neuroradiological findings. According to previous studies, CBA is more sensitive and specific than other anti-AQP4 IgG detection methods, and it can be applied to both clinical diagnosis and studies of NMOSD. The method has limitations; for example, an international scale to evaluate serum anti-AQP4 IgG titers is still lacking. Here, a detailed protocol for human serum anti-AQP4 IgG detection using CBA is described.

Cell-based assay is a widely used method to detect serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. This method could be applied to clinical diagnosis and scientific researches of neuromyelitis optical spectrum disorders.

Détection d’immunoglobuline Anti-aquaporin-4 G de sérum humain par Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Purification des préparations extracellulaires de vésicule à haut rendement loin du virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Analyses de compétence vectorielle sur les moustiques Aedes aegypti utilisant le virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...