Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (1R35GM133496-01) à Z. Gao. Nous tenons à remercier le Dr Ryan Hobbs pour son aide dans le sectionnement. Nous remercions les installations de base du Penn State College of Medicine, notamment les sciences du génome et la bioinformatique, l’imagerie par microscopie optique avancée et la cytométrie en flux. Nous remercions également le Dr Yuka Imamura pour son aide dans l’analyse de l’ARN-seq.

1. Culture mESC
<ol><li>Enduisez une plaque de 10 cm traitée par culture tissulaire de 0,1 % de gélatine et laissez la gélatine reposer pendant au moins 15 à 30 minutes avant de l’aspirer.</li>
	<li>Graine γ fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) irradiés un jour avant la culture des CSM dans le milieu mESC préchauffé (milieu Eagle modifié de Dulbecco avec 15% de sérum fœtal bovin (FBS), acides aminés non essentiels, β-mercaptoéthanol, L-glutamine, pénicilline/streptomycine, pyruvate de sodium, LIF, PD0325901 (PD) et Chir99021 (CH)).</li>
	<li>Laissez les MEF irradiés par γ se déposer et se fixer à la surface de la plaque avant de cultiver des cellules E14.</li>
	<li>Décongeler les CSE E14 au bain-marie à 37 °C et transférer rapidement les cellules dans un tube conique de 15 cm avec un milieu mESC chaud. Abattez les cellules à 200 x g pendant 3 min et retirez le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans 10 mL de milieu mESC et plaquer les cellules sur la plaque de culture contenant les MEF γ irradiés précédemment. Incuber la culture cellulaire dans un incubateur à 37 °C sous 5% de CO2.</li>
	<li>Pour le passage de culture, aspirer le milieu et laver la plaque avec 1x PBS stérile. Ajouter suffisamment de trypsine à 0,05 % pour recouvrir la surface de la plaque et incuber à 37 °C pendant 3 min.</li>
	<li>Neutraliser la trypsine avec un milieu mESC et une pipette pour générer une suspension monocellulaire. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 3 min et retirer le surnageant.</li>
	<li>Comptez les cellules avec un hémocytomètre ou un compteur de cellules et ensemencez environ 5,0 x 105 cellules dans une plaque de culture de 10 cm.</li>
	<li>Remettre les cellules en suspension dans 10 mL de milieu mESC, plaquer les cellules sur la plaque de culture tissulaire recouverte de gélatine et incuber des cultures comme décrit précédemment. REMARQUE: Il est recommandé que les CSM soient passés tous les 2 jours pour empêcher les cellules de se différencier dans leurs colonies. Le rouge de phénol dans le milieu fonctionne uniquement comme un indicateur de pH et en fonction de la densité cellulaire, il peut devenir jaunâtre (plus acide), plus tôt que 2 jours. Par conséquent, il peut être nécessaire de changer de support tous les jours. Les MEF γ irradiés finiront par mourir après quelques passages.</li>
</ol>2. EB, PNJ et différenciation des neurones
<ol><li>Effectuez le protocole de passage de culture mentionné précédemment et comptez les cellules (étapes 1.7-1.10).</li>
	<li>Méthode de la goutte suspendue (jour 0)<ol>
<li>Pour une plaque de culture cellulaire de 10 cm, comptez environ 2,5 x 104 cellules où 5,0 x 10 2 cellulesseront en suspension dans un milieu de différenciation de 20 μL (DMEM avec 15% de FBS, acides aminés non essentiels, β-mercaptoéthanol, L-glutamine, pénicilline/streptomycine et pyruvate de sodium). Environ cinquante gouttelettes de 20 μL contenant les cellules peuvent être plaquées sur une plaque de 10 cm.</li>
		<li>Aliquotez le nombre approprié de cellules, puis centrifugez les cellules à 200 x g pendant 3 min et retirez le surnageant.</li>
		<li>Remettre les cellules dans le volume approprié de milieu de différenciation pour une densité cellulaire de 5,0 x 102 cellules pour 20 μL (par exemple, 2,5 x 104 cellules dans 1 mL de milieu de différenciation).</li>
		<li>À l’aide d’une micropipette ou d’une pipette répéteur, placez 20 μL de gouttelettes de la suspension cellulaire sur le couvercle de la plaque de culture tissulaire. Assurez-vous que les gouttelettes ne sont pas trop proches les unes des autres pour les empêcher de fusionner. REMARQUE: Les gouttelettes peuvent être plaquées sur une plaque de fixation traitée par culture tissulaire ou une plaque de suspension car elles seront placées sur le couvercle et non sur la plaque elle-même. Pour une approche plus réalisable et stérile, plaquez les gouttelettes sur une plaque de culture tissulaire de fixation et transférez-les sur une plaque de suspension comme décrit ci-dessous.</li>
		<li>Remplissez la plaque avec 5 à 10 mL de 1x PBS et remettez soigneusement le couvercle sur la plaque. Incuber la culture dans l’incubateur à 37 °C. REMARQUE: PBS est ajouté à la plaque de culture pour empêcher les gouttelettes de se dessécher.</li>
	</ol></li>
	<li>Le jour 2,utilisez une micropipette pour recueillir les gouttelettes du couvercle et placez-les dans une plaque de suspension de culture cellulaire de 10 cm remplie de 10 mL de milieu de différenciation. Incuber la culture sur un shaker orbital secouant à basse vitesse dans l’incubateur.</li>
	<li>Le jour 4,pour récolter les EB, prélever les cellules, centrifuger à 200 x g pendant 3 min, et retirer le surnageant. REMARQUE: Les EB peuvent également être lavés avec 1x PBS selon les exigences des expériences ultérieures.</li>
	<li>Pour poursuivre la procédure et induire la différenciation EB en cellules progénitrices neurales (NPC), préparez le milieu de différenciation avec de l’acide rétinoïque (PR) de 5 μM.</li>
	<li>Retirez l’ancien milieu en abattant les EB à 100 x g pendant 3 min ou laissez les EB se déposer avant d’aspirer l’ancien milieu. Ajouter 10 mL du milieu de différenciation contenant 5 μM RA à la plaque de culture.</li>
	<li>Le jour 6, remplacez au moins la moitié du milieu par un milieu frais contenant 5 μM de RA en inclinant la plaque et en pipetant le milieu comme décrit ci-dessus. REMARQUE: Il est recommandé de remplacer au moins la moitié du milieu par un milieu frais contenant de la PR les jours 5 et 7. Prenez note de l’indicateur de rouge phénol; s’il devient jaunâtre, il est préférable de remplacer tout le milieu.</li>
	<li>Le jour 8,récoltez les PNJ en collectant les cellules, en centrifugant à 200 x g pendant 3 min et en retirant le surnageant. REMARQUE: Les PNJ peuvent également être lavés avec 1x PBS selon les besoins des expériences ultérieures. Si nécessaire, les PNJ peuvent être congelés et décongelés à nouveau pour une culture et une analyse ultérieures. Si les PNJ doivent être cultivés, l’accutase peut également être utilisée comme alternative à la trypsine.</li>
	<li>Pour poursuivre la procédure et différencier les PNJ en neurones, prélever les NPC dans un tube conique de 15 mL par centrifugation, les dissocier avec de la trypsine et les incuber à 37 °C pendant 3 min. Pipettez les PNJ pour s’assurer que tous les agrégats de PNJ sont dissociés et neutralisez la trypsine avec le milieu.</li>
	<li>Filtrer les cellules avec une passoire à cellules en nylon de 40 μm et compter les cellules avant de les plaquer à une densité de 1,5 x10 5/cm2 dans un milieu N2 (milieu DMEM/F12 + 3 mg/mL de glucose + 3 mg/mL d’albumine sérique bovine riche en lipides (LBSA) + supplément de N2 de 1:100 + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL de stylo/streptocoque + 1 mM de L-glutamine) sur une plaque traitée par culture tissulaire pour des expériences ultérieures de PCR et de transfert western; ou sur une chambre de culture tissulaire pour des expériences d’immunofluorescence.</li>
	<li>Le jour 9,remplacez l’ancien milieu par un milieu N2 frais.</li>
	<li>Le jour 10,changez le milieu N2 avec le milieu N2/B27 (50 % de DMEM/F12 et 50 % de basale neurale, 3 mg/mL de LBA, supplément de 1:200 N2, supplément de 1:100 B27, 50 U/mL de stylo/streptocoque et 1 mM de L-glutamine).</li>
	<li>Aux jours 11 à 12,récoltez les neurones comme suit. Laver les cellules avec 1x PBS, ajouter la trypsine et incuber la culture dans l’incubateur à 37 °C pendant 3 min avant de neutraliser la trypsine avec un milieu et de centrifuger à 200 x g pendant 3 min.</li>
</ol>3. Caractérisation des CSM et des cellules différenciées
<ol><li>Dosage de la phosphatase alcaline (AP) 
	<ol>
<li>Utilisez un kit pour évaluer l’activité de la phosphatase alcaline (voir le Tableau des matériaux).</li>
		<li>Retirez le milieu de la plaque de culture et lavez les ESC avec 1x PBS.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de la solution fixe (composée de formaldéhyde et de méthanol) fournie avec le kit à la plaque et l’incuber à température ambiante pendant 2 à 5 min. REMARQUE: Une sur-incubation dans la solution de réparation peut compromettre l’activité AP.</li>
		<li>Retirez la solution fixe, lavez les ESC avec 1x PBS et laissez une certaine quantité de PBS dans la plaque. REMARQUE: Gardez les CES humides dans PBS pour ne pas compromettre l’activité AP.</li>
		<li>Préparez la solution AP en mélangeant les solutions de substrat A, B et C au rapport 1:1:1. Mélanger d’abord les solutions A et B et incuber le mélange à température ambiante pendant 2 minutes avant d’ajouter la solution C.</li>
		<li>Retirez le PBS 1x et ajoutez la solution AP préparée précédemment.</li>
		<li>Incuber les ESC pendant environ 15 minutes dans l’obscurité en enveloppant la plaque de culture avec du papier d’aluminium ou en effectuant l’étape 3.5 dans une pièce sombre.</li>
		<li>Surveillez la réaction et retirez la solution réactionnelle lorsque la solution devient brillante pour éviter toute coloration non spécifique.</li>
		<li>Lavez les ESC deux fois avec 1x PBS.</li>
		<li>Empêchez l’échantillon de sécher en recouvrant les ESC de 1x PBS ou d’un support de montage. REMARQUE: Une tache rouge ou violette apparaîtra pour l’expression AP. La plaque peut être conservée dans un réfrigérateur à 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>RT-qPCR 
	<ol>
<li>Prélever des cellules à différentes étapes en suivant les étapes 1.6 à 1.7 et 2.4 pour les CES et les EB et les PNJ, respectivement.</li>
		<li>Isoler l’ARN à l’aide d’une solution d’extraction d’ARN, d’ADN et de protéines (voir Tableau des matériaux).</li>
		<li>Générez de l’ADNc avec un kit de transcriptase inverse (voir la table des matériaux)et suivez le manuel du fabricant.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixation et intégration 
	<ol>
<li>Récoltez les EB et les PNJ comme décrit ci-dessus (étape 2.6) et fixez-les avec une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4% dans 1x PBS pendant 30 min à température ambiante.</li>
		<li>Retirez le PFA et lavez l’échantillon avec 1x PBS pendant 5 min.</li>
		<li>Placer l’échantillon dans une dilution en série de 1x PBS, 10%, 20% et 30% de solutions de saccharose à 25\u201228 °C où l’échantillon est transféré à la solution suivante après 30 min d’incubation. REMARQUE: L’échantillon peut être conservé dans la solution de saccharose à 30% à 4 ° C avant de poursuivre l’étape d’incorporation.</li>
		<li>Mouiller l’embout de la pipette avec une solution de saccharose avant de placer l’échantillon (sans les empiler) au centre du cryo-moule et pipeter l’excès de liquide. REMARQUE: Le papier filtre peut également être utilisé pour éliminer l’excès de solution. Mouiller la pointe de la pipette avec une solution de saccharose est important pour empêcher les EB et les PNJ de coller aux parois de la pointe.</li>
		<li>Ajoutez soigneusement une solution de température de coupe optimale (OCT) au moule sans remettre les échantillons en suspension et éliminez les bulles en excès avec une pipette.</li>
		<li>Placez le moule avec l’échantillon sur un mélangeur de laboratoire à basse vitesse pour agiter légèrement l’échantillon pendant 15 min. Cela aide à régler les EB et les PNJ au fond s’ils sont remis en suspension dans la solution OCT.</li>
		<li>Congelez rapidement l’échantillon en plaçant la moisissure dans de l’azote liquide ou sur de la glace carbonique. REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés dans un congélateur à -70 ° C avant de passer à l’étape suivante.</li>
	</ol></li>
	<li>Cryosection 
	<ol>
<li>Réglez le cryostat pour qu’il refroidisse à -20 à -18 °C avant de transférer l’échantillon dans l’instrument.</li>
		<li>Détachez le bloc OCT congelé du moule et fixez-le sur le support avec une petite solution OCT placée sur la surface du support.</li>
		<li>Alignez le bloc OPO de sorte que les EB et les PNJ soient les plus proches de la lame pour vous assurer que l’échantillon n’est pas perdu pendant la section.</li>
		<li>Coupez soigneusement 10 μm du bloc et portez une attention particulière aux tranches qui contiennent l’échantillon.</li>
		<li>Placez rapidement la tranche d’OCT contenant l’échantillon sur la lame de verre d’incorporation de tissu et laissez les tranches d’OCT sécher à l’air libre pendant 1 h à température ambiante. REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés à -70 °C pour une utilisation ultérieure.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunofluorescence (FI) 
	<ol>
<li>Bloquer les sections OCT ou les chambres de culture contenant des neurones dans 10% de sérum d’âne normal / 0,1% de Triton X-100 dans 1x PBS pendant 1 h à température ambiante.</li>
		<li>Incuber les échantillons dans un anticorps primaire dilué dans du sérum d’âne normal à 5 % / 0,05 % de Triton X-100 dans 1x PBS pendant la nuit à 4 °C.</li>
		<li>Lavez les échantillons dans 1x PBS/0,1 % Triton X-100 trois fois pendant 5 min chaque lavage.</li>
		<li>Incuber les échantillons avec un anticorps secondaire dilué dans 5 % de sérum d’âne normal /0,05 % de Triton X-100 dans 1x PBS pendant 1 h à température ambiante.</li>
		<li>Laver les échantillons dans 1x PBS/0,1 % Triton X-100 trois fois pendant 5 min chaque lavage puis incuber les échantillons dans 1 μg/mL DAPI.</li>
		<li>Montez les échantillons avec un couvercle et un support de montage et laissez-le sécher.</li>
		<li>Observez les échantillons au microscope à fluorescence.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse de séquençage de l’ARN 
	<ol>
<li>Prélever les cellules à différents stades et effectuer une extraction de l’ARN (voir étape 3.2).</li>
		<li>Préparer les bibliothèques d’ADNc, effectuer un séquençage approfondi et une analyse des données selon le protocole décrit dans Wang et al.8.</li>
		<li>Effectuez l’analyse d’ontologie génique (GO) à l’aide du package R, clusterProfiler.</li>
	</ol></li>
	<li>Cytométrie en flux 
	<ol>
<li>Collectez les CSE en suivant les étapes 1.6 à 1.7 et remettez en suspension les cellules dans un milieu. Collectez les EB et les PNJ en suivant l’étape 2.4 et remettez en suspension les cellules dans un milieu.</li>
		<li>Filtrer la suspension cellulaire à l’aide de la passoire à cellules en nylon de 40 μm dans un nouveau tube conique de 15 mL.</li>
		<li>Mesurer le signal GFP des échantillons à l’aide du cytomètre en flux (effectué par l’installation centrale de l’établissement).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-layer:+The+case+for+3D+bioprinting+neurons+to+create+patient-specific+epilepsy+models.">Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models.</a> Materials. 12 (19), (2019).</li><li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture.">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li><li>Joshi, P., Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+imaging+(HCI)+on+miniaturized+three-dimensional+(3D)+cell+cultures.">High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures.</a> Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents.

La méthode de différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris est établie depuis des décennies et les chercheurs ont continué à modifier les protocoles précédents ou à en créer de nouveaux à des fins diverses7,10,11. Nous avons utilisé une série de tests pour analyser de manière exhaustive l’efficacité et la progression des étapes de différenciation des CSM en neurones, qui peuvent être...

Depuis leur première dérivation à partir de la masse cellulaire interne des blastocystes de souris en développement1,2,les cellules souches embryonnaires de souris (CSM) ont été utilisées comme outils puissants pour étudier l’auto-renouvellement et la différenciation des cellules souches3. En outre, l’étude de la différenciation des CSM conduit à une compréhension approfondie des mécanismes moléculaires qui peuvent améliorer l’efficacité et la sécurité de la thérapie à base de cellules souches dans le traitement de maladies telles que les troubles neurodégénératifs4. Par rapport aux modèles animaux, ce système in vitro offre de nombreux avantages, notamment la simplicité dans la pratique et l’évaluation, le faible coût de maintien des lignées cellulaires par rapport aux animaux et la facilité relative des manipulations génétiques. Cependant, l’efficacité et la qualité des types de cellules différenciés sont souvent affectées par différentes lignées de cSM ainsi que par les méthodes de différenciation5,6. En outre, les tests traditionnels pour évaluer l’efficacité de la différenciation reposent sur un examen qualitatif de gènes marqueurs sélectionnés qui manquent de robustesse et ne parviennent donc pas à saisir les changements globaux dans l’expression des gènes.
Ici, nous visons à utiliser une batterie de tests pour l’évaluation systématique de la différenciation neuronale. En utilisant à la fois des analyses in vitro traditionnelles sur des marqueurs sélectionnés et des séquençages d’ARN, nous établissons une plate-forme pour mesurer l’efficacité de la différenciation ainsi que les changements transcriptomiques au cours de ce processus. Sur la base d’un protocole précédemment établi7,nous avons généré des corps embryoïdes (EB) grâce à la technique de la goutte suspendue, suivie d’une induction utilisant une quantité supraphysiologique d’acide rétinoïque (PR) pour générer des cellules progénitrices neurales (NPC), qui ont ensuite été différenciées en neurones avec un milieu d’induction neuronal. Pour examiner l’efficacité de la différenciation, en plus des tests traditionnels de RT-qPCR et d’immunofluorescence (FI), nous avons effectué une cytométrie d’ARN-seq et de cytométrie en flux. Ces analyses fournissent une mesure complète de la progression de la différenciation spécifique au stade.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:805px;" width="804">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">25-052-CV</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">0.1% Gelatin</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">G1890-100G</td>
			<td>Prepared in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:127px;">28908</td>
			<td>Diluted in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">40-&#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:148px;">Falcon</td>
			<td style="width:127px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Albumax</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">11020021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:127px;">A11001</td>
			<td>Antibody was diluted at 1:500 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Alkaline Phosphatase Staining Kit II</td>
			<td style="width:148px;">Stemgent</td>
			<td style="width:127px;">00-0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox</td>
			<td style="width:148px;">Azura Genomics</td>
			<td style="width:127px;">AZ-2105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">BD FACSCanto</td>
			<td style="width:148px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">657338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">bFGF</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">11123149001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:148px;">Agilent</td>
			<td style="width:127px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Chir99021</td>
			<td style="width:148px;">Cayman Chemicals</td>
			<td style="width:127px;">13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Chloroform</td>
			<td style="width:148px;">C298-500</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Chemical</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">DAPI</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:127px;">R37606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">DMEM</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">10-017-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">EB buffer</td>
			<td style="width:148px;">Qiagen</td>
			<td style="width:127px;">19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Ethanol</td>
			<td style="width:148px;">111000200</td>
			<td style="width:127px;">Pharmco</td>
			<td>Diluted in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:148px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:127px;">S10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td style="width:148px;">Illumina</td>
			<td style="width:127px;">SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:148px;">BDH1133-4LG</td>
			<td style="width:127px;">BDH VWR Analytical</td>
			<td>Diluted in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">LIF</td>
			<td style="width:148px;">N/A</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td>Collected from MEF supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">m18srRNA primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-GCAATTATTCCCCATGAACG-3&#39; 
			5&#39;-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">MEM Non-essential amino acids</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">25-025-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mNanog primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3&#39; 
			5&#39;-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">mNes primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3&#39; 
			5&#39;-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">mNeuroD1 primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3&#39; 
			5&#39;-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mOct4 primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3&#39; 
			5&#39;-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mPax6 primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3&#39; 
			5&#39;-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">N2 supplement</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Nestin primary antibody</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td style="width:127px;">MAB5326</td>
			<td>Antibody was diluted at 1:200 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Neural basal</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Neurofilament primary antibody</td>
			<td style="width:148px;">DSHB</td>
			<td style="width:127px;">2H3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit</td>
			<td style="width:148px;">BioO Scientific</td>
			<td style="width:127px;">NOVA-5138-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">PD0325901</td>
			<td style="width:148px;">Cayman Chemicals</td>
			<td style="width:127px;">13034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:148px;">N/A</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td>Prepared in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">- Potassium chloride</td>
			<td style="width:148px;">P217-500G</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">- Potassium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td style="width:148px;">0781-500G</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">- Sodium chloride</td>
			<td style="width:148px;">BP358-10</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">- Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate</td>
			<td style="width:148px;">SX0715-1</td>
			<td style="width:127px;">Milipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Random hexamer primer</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:127px;">SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">R2625</td>
			<td>Prepared in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">25-000-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Sucrose</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">84097</td>
			<td>Diluted in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:127px;">18064022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:148px;">Sakura</td>
			<td style="width:127px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">TriPure Isolation Reagent</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">11667165001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">TruSeq Rapid</td>
			<td style="width:148px;">Illumina</td>
			<td style="width:127px;">20020616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:148px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:127px;">BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation and characterization of neural progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells

Nous décrivons la procédure étape par étape pour cultiver et différencier les cellules souches embryonnaires de souris en lignées neuronales, suivie d’une série de tests pour caractériser les cellules différenciées. Les cellules souches embryonnaires de souris E14 ont été utilisées pour former des corps embryoïdes par la méthode de la goutte suspendue, puis induites à se différencier en cellules progénitrices neurales par l’acide rétinoïque, et enfin différenciées en neurones. Des expériences quantitatives de réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse (RT-qPCR) et d’immunofluorescence ont révélé que les progéniteurs neuronaux et les neurones présentent des marqueurs correspondants (nestin pour les progéniteurs neuronaux et neurofilament pour les neurones) aux jours 8 et 12 après la différenciation, respectivement. Des expériences de cytométrie en flux sur une ligne E14 exprimant un rapporteur GFP piloté par le promoteur Sox1 ont montré qu’environ 60% des cellules au jour 8 sont GFP positives, indiquant la différenciation réussie des cellules progénitrices neurales à ce stade. Enfin, l’analyse ARN-seq a été utilisée pour profiler les changements transcriptomiques globaux. Ces méthodes sont utiles pour analyser l’implication de gènes et de voies spécifiques dans la régulation de la transition de l’identité cellulaire au cours de la différenciation neuronale.

En tant que représentation de notre méthode, nous avons effectué une expérience de différenciation EB, NPC et neuronale sur des cellules E14. Les cellules E14 ont été cultivées sur des MEF γ irradiés(figure 1A)jusqu’à ce que la population de MEF irradiés par γ se dilue. Nous avons confirmé la pluripotence des cellules E14 en effectuant une coloration à la phosphatase alcaline (AP)(Figure 1B)et plus tard rt-qPCR (voir ci-dessous) pour les marqueu...

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Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Nous décrivons la procédure de différenciation in vitro des cellules souches embryonnaires de souris en cellules neuronales en utilisant la méthode de la goutte suspendue. De plus, nous effectuons une analyse phénotypique complète par RT-qPCR, immunofluorescence, séquençage de l’ARN et cytométrie en flux.

Différenciation et caractérisation des progéniteurs neuronaux et des neurones à partir de cellules souches embryonnaires de souris

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

differentiation-characterization-neural-progenitors-neurons-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.7K vues.  Penn State Hershey Cancer Institute. Nous décrivons la procédure de différenciation in vitro des cellules souches embryonnaires de souris en cellules neuronales en utilisant la méthode de la goutte suspendue. De plus, nous effectuons une analyse phénotypique complète par RT-qPCR, immunofluorescence, séquençage de l’ARN et cytométrie en flux.

Vidéo: Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Différenciation neurale des souris de cellules souches embryonnaires dans le sérum sans culture monocouche

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Recherche

Biologie du développement

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

Régulation épigénétique de Cardiac Différenciation des cellules et tissus souches embryonnaires

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of pancreatic progenitor cells that can be used for the study of and future treatment of diabetes. This article outlines a four-stage differentiation protocol designed to generate pancreatic progenitor cells from human embryonic stem cells (hESCs). This protocol can be applied to a number of human pluripotent stem cell (hPSC) lines. The approach taken to generate pancreatic progenitor cells is to differentiate hESCs to accurately model key stages of pancreatic development. This begins with the induction of the definitive endoderm, which is achieved by culturing the cells in the presence of Activin A, basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and CHIR990210. Further differentiation and patterning with Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) and Dorsomorphin generates cells resembling the posterior foregut. The addition of Retinoic Acid, NOGGIN, SANT-1 and FGF10 differentiates posterior foregut cells into cells characteristic of pancreatic endoderm. Finally, the combination of Epidermal Growth Factor (EGF), Nicotinamide and NOGGIN leads to the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ cells. Flow cytometry is performed to confirm the expression of specific markers at key stages of pancreatic development. The PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors at the end of stage 4 are capable of generating mature &#946; cells upon transplantation into immunodeficient mice and can be further differentiated to generate insulin-producing cells in vitro. Thus, the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors, as demonstrated in this protocol, is of great importance as it provides a platform to study human pancreatic development in vitro and provides a source of cells with the potential of differentiating to &#946; cells that could eventually be used for the treatment of diabetes.

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Here we describe a 4-stage protocol to differentiate human embryonic stem cells to NKX6-1+ pancreatic progenitors in vitro. This protocol can be applied to a variety of human pluripotent stem cell lines.

Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; pancréatiques progéniteurs

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

L&#39;analyse des rétinoïque induite par l&#39;acide Neuro-Différenciation de cellules souches embryonnaires de souris en deux et trois dimensions corps embryoïdes

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

Isolement, Culture et différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse et les ostéoclastes progéniteurs de souris

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

Génération de cellules souches neurales induites à partir de cellules mononucléaires périphériques et différenciation vers les précurseurs du neurone dopaminergique pour les études de transplantation

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Différenciation neuronale efficace à l'aide de la culture monocellulaire des cellules souches embryonnaires humaines

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

Préparation de petites bibliothèques d’ARN pour le séquençage à partir d’embryons de souris précoces

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...