Ce protocole fournit une plate-forme de culture cellulaire où les propriétés de la matrice extracellulaire telles que la rigidité, la composition protéique et la morphologie cellulaire peuvent être contrôlées avec précision d’une manière rentable et facile. La méthode est rentable et ne nécessite pas de formation ou d’installations spéciales. Il est également compatible avec de multiples méthodes de quantification cellulaire telles que la coloration immunofluorescente et la tache occidentale.
Cette technique fournit une compréhension mécaniste de la biologie cellulaire de Schwann. Avec un aperçu supplémentaire de la conception des biomatériaux pour la régénération du système nerveux, il peut être appliqué à toutes les cellules dépendantes de l’ancrage. La partie la plus difficile de ce protocole, est l’impression microcontact.
Avant le début du protocole, l’impression de microcontact sur substrat à l’aide d’un florescent pour étiqueter la protéine pour vérifier visuellement l’impression finale au motif. Commencez par mélanger vigoureusement l’élastomer de base PDMS et les agents de séchage avec une pointe de pipette jusqu’à ce que les bulles soient dispersées de façon homogène dans le mélange. Ensuite, retirez les bulles avec la dessiccation sous vide.
Placez une goutte du mélange PDMS desséché sur un coverslip carré ou circulaire, et faites pivoter le coverslip sur un revêtement spin à 2500 rpm pendant 30 secondes. Incuber le coverslip dans un four à 60 degrés Celsius, pendant une à deux heures, ou à température ambiante pendant la nuit. Pour préparer un substrat à motifs micro, placez une plaquette de silicium à motifs à l’intérieur d’une plaquette circulaire de 150 millimètres de diamètre par boîte petri de 15 millimètres de hauteur et versez du PDMS dé-gazé sur la plaquette.
Solidifié le PDMS dans un four à 60 degrés Celsius pendant la nuit. Laisser refroidir le PDMS à température ambiante. Ensuite, utilisez un scalpel chirurgical pour couper des timbres de 30 par 30 millimètres carrés contenant les modèles corrects en prenant soin de ne pas endommager la plaquette de silicium.
Stériliser les timbres PDMS et les bordereaux de couverture réglables en les immergeant dans 70% d’éthanol pendant 30 minutes. Pour confirmer l’efficacité du micropatrin, séchez la surface des timbres PDMS à l’aide d’un flux d’air filtré et pipette 15 microgrammes par millilitre solution BSA pour couvrir l’ensemble du côté modelé du timbre. Incuber les timbres avec la solution BSA pendant une heure à température ambiante pour permettre l’adsorption protéique, puis sécher à l’air les timbres pour enlever la solution BSA.
Utilisez le flux d’air filtré pour sécher la surface des glissements de couvercle réglables. Mettre le côté modelé du timbre en contact conforme avec le coverslip réglable pour permettre l’adsorption BSA sur la surface de coverslip, et appuyez doucement sur le timbre contre le coverslip pendant cinq minutes. Examiner le micropattern à l’aide d’un microscope à fluorescence à l’aide d’un filtre FITC.
Pour imprimer les zones adhésives cellulaires plutôt que les motifs fluorescents remplacer la laminine par la protéine BSA. Retirez les timbres des feuillets de couvercle et transférez le couvercle dans une plaque stérilisée de six puits. Ajouter deux millilitres de solution Pluronique F-127 de 0,2 % dans chaque puits pour couvrir la surface du glissement du couvercle et incuber la plaque pendant une heure à température ambiante.
Aspirer la solution F-127 et laver le couvercle glisse cinq fois avec PBS, une fois avec le milieu de culture cellulaire, puis semer les cellules Schwann à une densité d’ensemencement de 1000 cellules par centimètre carré. 45 minutes après l’ensemencement cellulaire, retirer le milieu de culture cellulaire et laver le couvercle glisse deux fois avec PBS pour empêcher plusieurs cellules d’adhérer au même modèle. Maintenir les cellules dans l’environnement de culture cellulaire désiré pendant 48 heures avant la quantification.
Pour créer des substrats de culture cellulaire à motifs de ligne pour l’examen des cellules alignées, faites les timbres selon les instructions manuscrites et coupez-les aux dimensions désirées. Préparez deux boîtes de Petri recouvertes d’une surface PDMS réglable comme décrit précédemment, et effectuez l’impression de microcontact pour imprimer des zones adhésives cellulaires à motifs de ligne sur l’un des plats. Après avoir enlevé les timbres, remplissez la boîte de Petri de quatre millilitres de solution Pluronique F-127 de 0,2 % et incubez-la pendant une heure.
Rincez chaque côté du timbre PDMS trois fois avec 70 % d’éthanol et séchez-le avec de l’air. Faites pivoter les timbres PDMS et imprimez la zone adhésive cellulaire non patchée sur la deuxième boîte de Pétri comme décrit précédemment. Après avoir incubé les plats avec la solution F-127, retirez la solution et lavez la vaisselle trois fois avec du PBS et une fois avec un milieu de culture cellulaire fraîche.
Ensuite, les cellules de graines sur les plats, et les maintenir dans les conditions désirées pendant 48 heures avant de préparer les lysates. Pour préparer les lysates, laver les cellules avec du PBS glacé pendant deux minutes, puis ajouter 80 microlitres de solution RIPA, préparés selon les instructions manuscrites, sur chaque zone adhésive cellulaire, et incuber les cellules sur un bloc de glace pendant 25 minutes. Racler les cellules de Schwann avec le grattoir pendant cinq minutes et recueillir le lysate dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre étiqueté.
Centrifugeuse le lysate pendant 15 minutes à 12 milliers de fois G et quatre degrés Celsius. Recueillir le supernatant et le transférer dans un tube de microcentrifugeuse propre. Les substrats enduits de laminine ont eu comme conséquence un taux de prolifération plus élevé par rapport aux substrats enduits de collagène et de fibronectine.
Les cellules de Schwann sur des substrats avec le revêtement de laminine et le moduli différent ont prouvé que les substrats relativement plus doux ont diminué des taux de prolifération cellulaire. Les cellules ont également été analysées pour l’expression des protéines. L’expression transcriptionnelle de facteur c-Jun a été augmentée pendant que les substrats sont devenus plus doux.
Cependant, il a été considérablement réduit sur les substrats les plus doux. Sur les substrats rigides, les substrats enduits de collagène ont eu comme conséquence l’expression c-Jun la plus élevée, pendant que les substrats sont devenus plus doux, laminine a montré les niveaux les plus élevés de c-Jun. Les cellules ont ensuite été tachées de rhodamine-phalloidine pour explorer le rôle de la propagation cellulaire et de la zone dans l’expression c-Jun.
Lorsque des lignées adhésives cellulaires ont été créées sur les substrats de culture cellulaire, le rapport d’aspect nucléaire des cellules ensemencées sur le substrat de modèle a augmenté par rapport à celui des cellules sur des substrats non patchés. L’expression du récepteur de neurotrophine de c-Jun et de p75 ont été upregulated dans les cellules denses avec une plus petite zone de diffusion. Les cellules à motifs de ligne ont également eu comme conséquence une expression plus élevée du C-Jun et du P75 NTR par rapport aux cellules non patchées.
Des géométries adhésives à cellules imprimées microcontact ont été créées pour contrôler avec précision la zone de propagation cellulaire et l’allongement tout en éliminant les interactions cellule à cellule. L’augmentation du rapport d’aspect cellulaire a provoqué l’allongement nucléaire pour augmenter. L’expression de c-Jun a été augmentée par l’allongement cellulaire et l’inhibition de propagation cellulaire.
La coloration d’immunofluorescence pour les noyaux et l’actine a confirmé que la zone de propagation cellulaire et l’allongement ont été précisément contrôlés par cette méthode de micropatration. Cette technique a ouvert la voie à l’utilisation de nos substrats tunable comme méthode pour analyser mécaniquement la biologie cellulaire de Schwann et la signalisation dans le contexte de la régénération et du cancer.
