L’hypoxie est un facteur clé du développement du cancer qui induit une instabilité génomique et une tumorigenèse. Nous démontrons une méthode pour générer une hypoxie centrale dans un cancer solide in vitro basée sur la technologie de bioimpression 3D. En utilisant cette méthode, un gradient radio hypoxique peut être reproduit à l’aide d’une stratégie simple qui combine une barrière perméable au gaz imprimée en 3D et un couvercle en verre.
Cette technologie sur puce de cancer hypoxique peut être employée pour prévoir l’efficacité de drogue pour faciliter la prescription spécifique patient de drogue anticancéreuse. Et on s’attend également à ce qu’il permette un diagnostic rapide des cancers agressifs. Pour aider à la préparation d’une solution de pré-gel de collagène neutralisée de trois millilitres, couper des éponges de collagène de 30 milligrammes en un cinq par cinq millimètres au carré.
Placez les morceaux dans un flacon en verre stérile de 10 millilitres et ajoutez 2,4 millilitres de filtre à seringue de 0,2 micron 0,1 acide chlorhydrique normal au flacon pour une incubation de trois jours à quatre degrés Celsius et 15 tours par minute. Après la digestion, filtrer toutes les particules de collagène non digérées à travers une passoire cellulaire de 40 microns et stocker la solution de collagène acide à quatre degrés Celsius pendant sept jours. Pour ajuster le pH de la solution de prégél gel de collagène neutralisée à 1%, ajouter 30 microlitres de solution rouge de phénol à une concentration finale de 1% et 300 microlitres de PBS 10X à une concentration finale de 10%Après mélange et centrifugation, utilisez un hydroxyde de sodium normal pour neutraliser le pH à sept, en vérifiant le changement de couleur et ajoutez de l’eau distillée pour obtenir un volume total de trois millilitres.
Ensuite, conservez la solution de pré-gel de collagène neutralisée à 1% ajustée au pH à quatre degrés Celsius pour une utilisation dans les trois jours. Pour préconcérifier la gélification de la solution de pré-gel de collagène neutralisée, utilisez une pipette à déplacement positif pour ajouter 50 microlitres de gouttelettes de collagène à un petit plat et incuber les gouttelettes dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure. À la fin de l’incubation, vérifiez si le collagène est passé d’une couleur transparente à un blanc opaque.
Inclinez le récipient pour confirmer que le collagène adhère au fond du récipient. Et versez du PBS sur la gouttelette pour confirmer que la construction de collagène ne se casse pas en solution. Pour l’impression 3D d’un moule PEVA sacrificiel, cliquez sur Fichier et enregistrez le type de fichier en tant que STL pour convertir le fichier CAO 3D en fichier STL, puis cliquez sur Option et formulaire de sortie au format ASCII pour générer le code G.
Pour importer le fichier STL généré, cliquez sur Fichier et ouvrez le fichier STL et sélectionnez le fichier STL enregistré. Pour générer automatiquement le code G du moule PEVA sacrificiel, sélectionnez le modèle de tranche de l’échangeur STL-CAD. Ensuite, pour générer des chemins d’impression pour la fabrication de la puce, utilisez une buse de précision de 50 calibres à une pression pneumatique de 500 kilopascals à 110 degrés Celsius pour imprimer le moule PEVA sacrificiel sur une lame d’histologie hydrophile adhésive adhésive stérile.
Pour couler la barrière PDMS, mélanger six millilitres d’élastomère de base PDMS et 600 microlitres d’agent de durcissement pendant cinq minutes dans un réservoir en plastique et charger la solution mélangée de manière homogène dans une seringue jetable de 10 millilitres. Equipé la seringue d’une pointe de distribution conique en plastique de 20 calibres et remplissez le moule PEVA sacrificiel avec la solution PDMS mélangée. Le PDMS mélangé remplira ce moule PEVA sacrificiel avec une surface convexe et la barrière sera plus haute que celle du moule.
Après avoir durci la barrière PDMS dans un four à 40 degrés Celsius pendant plus de 36 heures pour éviter de faire fondre la PEVA, utilisez une paire de pinces de précision pour détacher le moule PEVA sacrificiel et stérilisez la barrière perméable au gaz à 120 degrés Celsius dans un autoclave. Pour mélanger la solution avec des cellules cancéreuses, remettre en suspension chaque type de pastille de cellules collectées dans 20 microlitres de milieu de culture et ajouter un millilitre de solution de pré-gel de collagène neutralisé à 1% dans chacune des suspensions cellulaires remises en suspension sur de la glace humide avec un mélange doux. Utilisez une pipette à déplacement positif pour mélanger chaque suspension de cellule.
Lorsque des solutions homogènes sont obtenues, utilisez une pipette jetable positive pour transférer les bioinks de collagène encapsulés cellulaires dans des seringues jetables individuelles de trois millilitres et stockez les seringues à quatre degrés Celsius jusqu’à l’impression cellulaire 3D. Pour l’impression 3D d’anneaux concentriques cancer-stroma, convertissez le fichier CAO 3D approprié dans un format de fichier STL et utilisez un échangeur STL-CAD pour générer un code G des anneaux concentriques cancer-stroma. Chargez les bioinks de collagène encapsulés de la cellule dans la tête d’imprimante 3D et réglez la température de la tête et de la plaque à 15 degrés Celsius.
Chargez le chemin d’impression généré sur le logiciel de contrôle de l’imprimante 3D et cliquez sur Démarrer pour imprimer les bioinks de collagène sur la barrière perméable au gaz selon le code G chargé avec une aiguille en plastique de calibre 18 à une pression pneumatique d’environ 20 kilopascals à 15 degrés Celsius. À la fin de chaque opération d’impression, placez manuellement un couvercle en verre stérilisé de 22 x 50 millimètres sur la barrière perméable au gaz pour générer le gradient hypoxique. Après avoir généré trois cancer-sur-puces hypoxiques, transférez les puces dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure pour réticuler les bioinks de collagène.
Lorsque tous les cancer-sur-une-puce hypoxique ont été imprimés, frotté doucement les verres de couverture sur le dessus des barrières perméables au gaz avec un grattoir de cellules pour une liaison serrée. Pour rafraîchir le milieu de culture cellulaire aux puces sans détacher la construction cancéreuse, inclinez les puces et utilisez une pipette pour introduire 1,5 millilitres de milieu de croissance cellulaire endothéliale sur le côté de chaque puce. Le cancer-sur-une-puce hypoxique a été conçu sous forme d’anneaux concentriques pour imiter la diffusion et l’épuisement radiaux de l’oxygène observés dans les tissus de cancer.
Après avoir défini le volume de contrôle d’un espace dans lequel l’oxygène est diffusé et consommé par les cellules, une densité cellulaire appropriée pour la génération d’hypoxie centrale peut être déterminée par une analyse computationnelle par éléments finis. Lors de l’impression cellulaire 3D, une structure compartimentée en anneau concentrique cancer-stroma peut être créée pour reproduire les caractéristiques anatomiques du cancer solide. Quantitativement, la viabilité des cellules post-impression est généralement supérieure à 96%, ce qui confirme que les conditions de fabrication sont appropriées pour le cancer et les cellules stromales.
Dans cette analyse représentative, deux groupes ont été comparés en fonction de la présence et de l’absence du gradient d’oxygène pour vérifier les effets d’un gradient hypoxique sur la progression du cancer. Dans les deux conditions, des cellules endothéliales CD31 positives matures étaient présentes dans les régions périphériques, ce qui indique que des constructions vivantes spatialement modelées ont été produites à l’aide de la technologie de bioimpression 3D. Comparé à l’état négatif de gradient d’oxygène l’état positif de gradient a démontré un gradient hypoxique, indiquant l’expression progressive de l’alpha HIF1.
On a également observé les cellules pseudopalisaded positives SHMT2 et les cellules pluripotentes positives SOX2, indicatives de la présence des dispositifs pathophysiologiques agressifs du cancer plein. Le cancer-sur-une-puce hypoxique est un outil utile pour étudier les caractéristiques pathophysiologiques des cancers solides et la diaphonie dynamique entre les cellules cancéreuses et le tumorigenesis favorisant le microenvironnement. Comme la méthodologie peut être adaptée à la conception d’un médicament spécifique au patient dans un délai raisonnable, cette approche devrait combler l’écart entre les modèles in vivo et in vitro de cancer.
