Ce protocole permet d’évaluer le mécanisme de greffe d’îlots dans le tissu adipeux blanc. Le principal avantage de cette méthode de transplantation d’îlots couverts de graisse est qu’elle est techniquement facile à reproduire. La méthode peut être appliquée à d’autres modèles de maladies.
Par exemple, il peut être utilisé pour créer un modèle murin de cancer. Naoaki Sakata, professeur agrégé à l’Université de Fukuoka, fera la démonstration de la procédure. Sous un microscope à dissection, utilisez une micropipette P 200 pour enlever tous les composants supplémentaires des îlots pancréatiques, y compris les tissus acineux et fibreux.
Ensuite, utilisez une passoire cellulaire pour filtrer les cellules acineuses individuelles. Transférer les îlots filtrés dans une nouvelle boîte de culture contenant le milieu de culture approprié ou la solution tampon complétée par du sérum bovin ou de l’albumine, et agiter la capsule pour positionner les îlots au centre. À l’aide d’une micropipette P 200, prélever les îlots individuels dans un tube de collecte approprié.
Placez une nouvelle crépine cellulaire de 40 micromètres sur un tube en plastique de 50 millilitres. Utilisez une pipette de 1000 microlitres pour ajouter les îlots à la passoire afin de séparer les îlots et les cellules acineuses simples. Utilisez une pince pour retourner la passoire sur une nouvelle boîte de culture non traitée de 60 ou 100 millilitres contenant un milieu de culture ou une solution tampon appropriée, complétée par du sérum bovin ou de l’albumine.
Utilisez un milieu frais ou un tampon pour rincer les îlots dans une nouvelle boîte de culture, puis ajoutez suffisamment de milieu ou de tampon à la boîte de culture pour atteindre un volume total d’environ 20 millilitres. Comptez les îlots au microscope et divisez le nombre d’îlots également entre des tubes centrifugés en plastique individuels de 1,5 millilitre en fonction du nombre d’animaux donneurs. Centrifuger les îlots à 2,100 G pendant une minute à température ambiante et jeter le surnageant.
Environ 20 à 30 microlitres de solution résiduelle resteront généralement dans le tube. Après avoir retiré les poils de l’abdomen pour prévenir l’infection, placez la souris en décubitus dorsal. Après avoir désinfecté l’abdomen et la région inguinale, incitez la peau au niveau de la zone médiane inférieure, créant une incision cutanée d’environ deux centimètres de long.
Serrez la paroi abdominale gauche avec des pinces ou des rétracteurs et tirez le tissu vers le côté gauche de la souris pour sécuriser le champ chirurgical. Utilisez un coton-tige pour mobiliser l’intestin grêle et le gros intestin du côté droit de la souris. Le tissu adipeux blanc épidermique gauche dans la cavité abdominale est situé dans la région inguinale gauche.
Mobiliser le tissu adipeux blanc épidermique et le testicule gauche à l’extérieur de l’abdomen et étirer le tissu. Utilisez une micro-pipette P 200 pour recueillir tout le volume des îlots à partir d’un tube de 1,5 millilitre, en veillant à ce qu’il ne reste aucun îlot dans le tube lors de la collecte. Permettre aux îlots collectés de s’installer à l’extrémité de la pipette par gravité.
Placez légèrement l’embout de la micropipette sur le tissu adipeux distendu, en prenant soin d’éviter un rinçage excessif du milieu ou du tampon dans l’embout. Ensemencez soigneusement les îlots sur le tissu. Après l’ensemencement, confirmez le placement correct des îlots sous un microscope à dissection.
Couvrir les îlots avec le tissu adipeux blanc épidermique, puis placer le testicule gauche sous le tissu adipeux blanc épisomique et renvoyer les tissus dans la cavité intrapéritonéale. Fermez la peau en deux couches à l’aide d’une suture 4-o. Lorsque vous avez terminé, placez la souris sous une lampe chauffante et surveillez-la jusqu’à la récupération complète.
Pour comparer l’efficacité de la transplantation d’îlots couverts de graisse à celle après la transplantation intrapéritonéale d’îlots, le même nombre d’îlots a été implanté sur le péritoine à l’espace paracolique gauche des animaux diabétiques receveurs témoins. On a observé que les niveaux de glucose sanguin des souris ayant subi une transplantation d’îlots couverts de graisse diminuaient progressivement et significativement par rapport aux souris transplantées d’îlots intrapéritonéaux. Un test de tolérance au glucose intrapéritonéal a été effectué un mois après la transplantation.
La glycémie chez les souris ayant subi une greffe d’îlots couverts de graisse a été maintenue à des niveaux inférieurs à ceux observés chez les souris transplantées d’îlots intrapéritonéaux. L’examen histologique a été utilisé pour évaluer la greffe d’îlots dans le tissu adipeux blanc épidermique. Chez les animaux receveurs de greffe d’îlots couverts de graisse, la coloration éocène à l’hématoxyline a révélé la présence d’îlots dans le tissu adipeux blanc épidermique.
De plus, la coloration par anticorps conjugués par fluorescence des îlots insuliniques positifs a facilité la détection de microvaisseaux positifs au facteur von Willebrand dans le tissu adipeux blanc épidermique de toutes les souris receveuses. Pour réussir cette procédure, assurez-vous de laisser les îlots se déposer complètement à l’extrémité de la pipette et de les ensemencer sur le tissu adipeux sans les renverser.
