Ce protocole peut améliorer considérablement l’expansion ex vivo de cellules NK fonctionnelles, non exhaustives, de type mémoire par rapport à d’autres cellules nourricières basées sur un système d’expansion. Il s’agit d’une méthode plus simple par rapport à d’autres protocoles utilisant des cellules d’alimentation dans lesquelles nous sautons l’étape d’isolement des cellules NK avant l’expansion des cellules NK. Ce protocole peut fournir un nombre suffisant de cellules NK et CAR-NK pour l’immunothérapie.
Cette technique est hautement reproductible. Cependant, il est crucial d’utiliser des matériaux de départ frais et neufs et de veiller à ne pas perturber les cellules NK pendant les premiers jours d’expansion. Commencez par identifier et sectionner les zones tissulaires viables à l’aide d’un équipement chirurgical stérile pour obtenir des lymphocytes.
Ensuite, placez les tissus sectionnés dans 30 millilitres de HBSS sans calcium ni magnésium et gardez le tissu sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’isolement. En travaillant à l’intérieur d’une armoire de biosécurité, hacher le tissu en cubes de moins de 0,5 centimètre avec des lames de rasoir et des pinces stériles. Placez les morceaux de tissu hachés, pas plus de 4 grammes, dans les tubes dissociateurs tissulaires et ajoutez 10 millilitres de collagénase IV aux morceaux de tissu.
Pour hacher soigneusement le tissu, traitez les tubes dissociateurs tissulaires dans un dissociateur tissulaire à 37 degrés Celsius. Après avoir retiré les tubes du dissociateur tissulaire, triturer le tissu haché à travers une crépine à cellules en nylon de 40 microns à l’aide de l’extrémité arrière d’une seringue de 5 millilitres. Jetez les gros fragments non digérés.
Faire tourner l’éluant recueilli à 400G pendant 5 minutes à température ambiante et aspirer le surnageant avant de remettre en suspension les granulés cellulaires dans de la silice enrobée de polyvinylpyrrolidone à 30% pour éliminer les cellules graisseuses. Faites tourner les cellules comme décrit avant de remettre en suspension la pastille de cellule dans 9 millilitres de milieu R-10. Pour séparer les lymphocytes des globules rouges et des cellules polymorphonucléaires, superposez soigneusement la suspension cellulaire sur 4 millilitres de Ficoll ou de milieu de séparation des lymphocytes.
Séparez les couches en centrifugeant à 400G pendant 23 minutes à température ambiante avec l’accélération et les freins coupés. Ensuite, décantez soigneusement la couche moyenne supérieure et récoltez l’interphase contenant les lymphocytes infiltrant les tissus. Rincez les cellules avec 10 millilitres de milieu et procédez à l’analyse ou au protocole d’expansion des cellules tueuses naturelles primaires, ou NK.
Lavez les cellules mononucléées du sang périphérique, ou PBMC, et 100 cellules 221-mIL-21 irradiées aux rayons gamma séparément par centrifugation à 400G pendant 5 minutes avec 10 millilitres de milieu R-10. Après centrifugation, conserver 1 x 10 au 6ème PBMC pour la cytométrie en flux et mélanger 5 x 10 au 6ème PBMC avec 10 x 10 à 6ème 100 cellules gamma-irradiées 221-mIL-21 dans une plaque spéciale à 6 puits. Ajouter 30 millilitres de milieu R-10 complété par de l’interleukine-2 humaine et de l’interleukine-15 humaine à la même plaque à 6 puits et incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone, en remplaçant le média tous les 3 à 4 jours.
Pendant l’incubation, enregistrer la viabilité totale du nombre de cellules tueuses naturelles du sang périphérique, ou PBNK, et effectuer une cytométrie en flux tous les 3 à 4 jours pour calculer le taux d’expansion des cellules NK. Ajouter 1,8 x 10 aux 6e cellules 293T dans 11 millilitres du milieu D-10 par plaque de 100 millimètres traitée et incuber les cellules 293T à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Dans un tube de 1,70 millilitre, mélanger 470 microlitres du milieu sérique réduit avec 30 microlitres du réactif de transfection.
Dans un tube séparé de 1,70 millilitre, ajouter 2,5 microgrammes de plasmide pRDF, 3,75 microgrammes de plasmide Pegpam3 et 2,5 microgrammes de construction CAR dans le vecteur SFG dans le milieu sérique réduit pour obtenir le volume final de 500 microlitres. Mélanger le contenu du tube avec le tube de 1,70 millilitre préparé plus tôt de manière goutte à goutte. Après 15 minutes d’incubation à température ambiante, ajoutez 1 millilitre du mélange du tube à la plaque cellulaire 293T de manière goutte à goutte et placez la plaque à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 48 à 72 heures.
Diluer la protéine rétronectine avec du PBS à une concentration finale de 50 à 100 microgrammes par millilitre. Ajouter 500 microlitres de rétronectine diluée dans chaque puits d’une plaque non traitée de 24 puits. Ensuite, scellez la plaque à l’aide d’un parafilm et incuber la plaque à 4 degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, centrifuger la plaque de rétronectine à 2, 103G pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius et jeter le surnageant. Après avoir bloqué chaque puits de la plaque de 24 puits avec 1 millilitre de milieu R-10, incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 1 heure. Filtrer les cellules 293T précédemment transfectées à l’aide d’un filtre de 0,45 micron pour recueillir le surnageant rétrovirus.
Aliquote 2 millilitres du surnageant de rétrovirus filtré dans chaque puits de la plaque de rétronectine à 24 puits. Centrifuger la plaque de rétronectine de 24 puits à 2, 103G pendant 2 heures dans une centrifugeuse préchauffée à 32 degrés Celsius. Pendant que les plaques sont centrifugées, collectez les cellules PBNK expansées à partir du jour 0 et comptez les cellules à l’aide de Trypan Blue.
Diluer les cellules PBNK expansées avec des milieux R-10 supplémentés en interleukine-2 et interleukine-15 à la concentration de 2,5 x 10 à la 5ème à 5 x 10 à la 5ème cellules par millilitre. Après centrifugation de la plaque de rétronectine à 24 puits, aspirer partiellement le surnageant rétroviral de chaque puits. Ensuite, ajoutez 2 millilitres de cellules PBNK expansées diluées à chaque puits.
Centrifuger la plaque à 600G pendant 10 minutes à 32 degrés Celsius avant d’incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 48 à 72 heures. Transférer les cellules de la plaque de 24 puits dans un tube de centrifugation de 50 millilitres pour centrifuger le tube à 400 G pendant 5 minutes. Après avoir remis la pastille en suspension avec 1 millilitre de milieu R-10, transférer les cellules remises en suspension dans une plaque spéciale à 6 puits contenant 30 millilitres de milieu R-10 complété par de l’interleukine-2 et de l’interleukine-15.
Incuber la plaque spéciale à 6 puits à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec un média rafraîchissant et calculer le taux d’expansion de la cellule NK tous les 3 à 4 jours. Les cellules PBNK élargies de 221-mIL-21 se sont étendues de près de 5 x 10 au 4ème pli. Et la pureté des cellules NK a été maintenue à environ 85% tout au long de l’expansion de 21 jours.
Avant l’expansion, la robustesse du système d’expansion 221-mIL-21 a été examinée en colorant les PBMC pour l’anti-CD56 et l’anti-CD3, qui ont montré une pureté cellulaire de 7,09% pour les cellules NK et un pourcentage élevé de cellules T. Le jour 4 de la coculture PBMC et 221-mIL-21, la pureté NK a été vérifiée avant la transduction CAR-NK. Les cellules CAR-NK colorées pour les IgG anti-CD56, anti-CD3 et anti-humains ont montré une population élevée de cellules NK au jour 7 et une efficacité de transduction CAR élevée d’environ 70% a été observée.
Le 18ème jour, l’expression de CAR dans divers sous-ensembles a été vérifiée par cytométrie en flux. Après l’expansion des cellules NK, les cellules peuvent être utilisées pour des essais fonctionnels in vitro ou pour des expériences in vivo. Les chercheurs peuvent utiliser ce protocole pour étendre NK et CAR-NK aux patients présentant un déficit fonctionnel en NK ainsi qu’à d’autres espèces, telles que le chien.
