Ce protocole est significatif parce que peut être employé pour étudier la présence du biomarqueur de gliome par une méthode qui préserve la structure 3D des neurosphères de tumeur. Le principal avantage de ce protocole est que la morphologie des neurosphères est maintenue par rapport à la méthode de cytospin dans laquelle les cellules sont soumises à une manipulation stressante et s’aplatir. Cette méthode peut être appliquée à tous les autres systèmes de culture tissulaire dans lesquels les cellules sont cultivés en 3D et le maintien de la structure est important.
Pour commencer, la culture des neurosphères tumorales ou NS dans un flacon T-25 jusqu’à ce que les cellules sont confluentes. Élire la tumeur NS dans un tube conique de 15 millilitres. Impellet la NS à 300 Gs pendant cinq minutes.
Après cela, suspendre à nouveau la pastille en un millilitre de 10% de formaline et incuber le tube à température ambiante pendant 10 minutes. Ajouter cinq millilitres de HBSS à la NS re-suspendue. Impellet les cellules comme précédemment décrit. Placer le tube contenant la pastille sur la glace.
Suspendre à nouveau la pastille NS lavée dans 500 microlitres d’agarose liquide chaud à deux pour cent. Et mélanger par un tuyau doux ou en remuant. Placez l’agarose en NS intégrée sur la glace jusqu’à ce que l’agarose polymérise.
Retirez ensuite le morceau d’agarose, en tenant le NS. Placer le morceau d’agarose dans une cassette pour le traitement des tissus. Réglez un bain d’eau à 42 degrés Celsius. Et insérez soigneusement la lame dans le microtome.
Ensuite, placez le bloc de paraffine dans la microtome. D’une main, appuyez sur le levier qui contrôle l’épaisseur de chaque section située sur le côté gauche de la machine. Appuyez sur le levier au deuxième arrêt pour régler le microtome à une épaisseur de 30 micromètres.
Tournez la roue à main grossière pour commencer à couper le bloc. Une fois que la surface de l’échantillon est presque exposée, réglez le levier qui contrôle l’épaisseur à cinq ou 10 micromètres. Arrêtez de tailler lorsque la surface de l’échantillon est atteinte.
Remplissez une glacie de glace et juste assez d’eau pour protéger le bloc de paraffine contre le toucher directement de la glace. Jetez l’ancienne lame de microtome et insérez-en une nouvelle pour la sectionnement. Séchez le bloc de paraffine avec de la gaze et placez-le sur la microtome.
Tournez la roue à main grossière pour commencer à sectionner la paraffine. Ensuite, utilisez un pinceau humide pour transférer le ruban de paraffine au bain d’eau de 42 degrés Celsius. À l’aide de la courbe des forceps, placez les forceps entre deux sections de paraffine et repoussez doucement les sections.
Utilisez le pinceau humide pour pousser les sections séparées sur des glissières de microscope à adhérence chargées positivement. Tout d’abord, faire fondre la paraffine en incubant les glissières dans une grille métallique à 60 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, déparaffiniser les diapositives par incubation dans un train de réhydratation à température ambiante selon le protocole du texte.
Conservez les glissières dans l’eau du robinet pour éviter la fixation non spécifique des anticorps. Après cela, incuber les diapositives dans le tampon de citrate à 125 degrés Celsius pendant 30 secondes et 90 degrés Celsius pendant 10 secondes. Laisser refroidir les glissières avant de les rincer cinq fois avec de l’eau distillée.
Ensuite, incubez les glissières à température ambiante en peroxyde d’hydrogène de 0,3 % pendant 20 minutes. Ensuite, lavez les glissières pendant cinq minutes, trois fois dans le tampon de lavage avec une agitation douce. Incuber les glissières pendant la nuit dans une chambre humidifiée réglée à quatre degrés Celsius avec des anticorps primaires dilués.
Après cela, laver les diapositives trois fois pendant cinq minutes avec une agitation douce. Ensuite, incubez les glissières dans des anticorps secondaires biotinylés dilués à température ambiante pendant une heure. Lavez les glissières trois fois pendant cinq minutes dans un tampon de lavage avec une légère agitation.
Ensuite, incubez les glissières dans le complexe de peroxydées de raifort avidin-biotinylated à température ambiante dans l’obscurité pendant une heure. Répétez le lavage tel que décrit précédemment. Après cela, incuber les diapositives avec des marques de substrat de peroxyde d’hydrogène DAB pendant deux à cinq minutes à température ambiante.
Rincez les glissières à l’eau du robinet et trempez les glissières dans la solution d’hématoxyline pour les contrer. Rincez ensuite soigneusement les glissières dans l’eau du robinet jusqu’à ce que l’eau soit claire. Déshydratez les diapositives selon le protocole du texte.
Enfin, couvrez les glissières avec un milieu de montage à base de xylène et laissez-les sécher sur une surface plane à température ambiante. Dans ce protocole, ns sont fixés et incorporés dans l’agarose et la paraffine. Et puis ils sont tachés pour des biomarqueurs gliomes spécifiques.
Le niveau d’expression d’ATRX, une protéine chaperon qui médie la structure de la chromatine, est faible. Ki67, un biomarqueur de la prolifération cellulaire, est positif dans le gliome NS. Enfin, les NS sont également positifs pour OLIG2, un facteur de transcription qui médie la différenciation oligodendrocyte. La chose la plus importante à retenir est de re-suspendre les cellules bien dans l’agarose chaude avant de transférer à la glace, pour assurer une distribution égale des neurosphères.
