La chromatographie d’exclusion de taille est une approche utile pour séparer les sous-populations de vésicules bactériennes de taille hétérogène et pour éliminer les acides nucléiques et les protéines des surnageants bactériens. La chromatographie d’exclusion de taille est moins coûteuse, plus rapide et plus reproductible que les autres techniques de séparation, y compris l’ultracentrifugation par gradient de densité. Nous avons démontré le potentiel de cette approche en utilisant les vésicules d’A.actinomycetemcomitans, mais nous nous attendons à ce qu’elle puisse également être appliquée à d’autres populations de vésicules bactériennes de taille hétérogène.
Assurez-vous de bien dégazer toutes les solutions de tampon et de perles et de pipeter la solution lentement sans introduire de bulles, mais assez rapidement pour que les billes s’emballent de manière homogène sans se dessécher. Pour commencer, utilisez une tige de verre pour mélanger un flacon de milieu de filtration en gel et versez le volume nécessaire pour remplir la colonne plus environ 50% d’excès dans une bouteille en verre. Laissez les perles se déposer et décanter l’excès de liquide.
Resuspendez les billes dans un tampon d’élution en une solution finale d’environ 70% de gel et 30% de tampon et dégazez la solution sous vide. Montez la colonne sur un support annulaire en position verticale et remplissez la colonne avec un tampon d’élution pour mouiller les parois avant de drainer le tampon jusqu’à ce qu’il ne reste qu’environ un centimètre. Ensuite, pipetez soigneusement les billes de gel dans la colonne tout en drainant simultanément l’excès de tampon pour empêcher les perles de se déposer jusqu’à ce que la colonne soit emballée à une hauteur d’environ deux centimètres au-dessous du fond du réservoir de la colonne.
Avant de charger l’échantillon, dégazez le tampon d’élution sous vide. Lavez la colonne avec environ deux fois le volume de colonne du tampon d’élution. Une fois que le tampon atteint le sommet de la couche de gel, ajoutez soigneusement deux millilitres d’un échantillon de vésicule de membrane externe de 100 à 200 nanomolaires par litre sur le dessus de la couche de gel sans perturber la surface et laissez l’échantillon entrer dans le gel.
Ajoutez lentement le tampon d’élution à la colonne sans perturber la couche de gel et placez un tube de 50 millilitres sous la colonne. Pour éviter que la colonne ne sèche, ajoutez simultanément un tampon d’élution en haut de la colonne. Après avoir recueilli 20 millilitres d’éluat, placez un rack de tubes de 1,5 millilitre sous la colonne.
Collectez un total de 96 fractions d’un millilitre dans chaque tube. Lors de la collecte des échantillons, ajoutez continuellement un tampon d’élution à la colonne. Pour nettoyer la colonne, exécutez un volume de colonne d’hydroxyde de sodium molaire 0,1 à travers la colonne, suivi de deux volumes de colonne de tampon d’élution.
Pour mesurer les concentrations lipidiques, pipettez 50 microlitres de chaque fraction dans une plaque de 96 puits. Ajouter 2,5 microlitres de colorant lipophile à chaque puits. Après 15 secondes, mesurez l’intensité de la floraison.
Pour mesurer la concentration d’une protéine d’intérêt, ajoutez 100 microlitres de chaque fraction dans les puits individuels d’une plaque immunologique ELISA. Après trois heures à 25 degrés Celsius, décantez le contenu de la plaque. Lavez la plaque cinq fois avec 200 microlitres de tampon de lavage ELISA par lavage en décant la plaque après chaque lavage.
Ajoutez 200 microlitres de tampon bloquant à chaque puits pour une incubation d’une heure à 25 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, décantez la plaque et ajoutez 100 microlitres d’anticorps primaires dans un tampon bloquant pour une incubation de nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, décantez la plaque et lavez la plaque cinq fois avec un tampon de lavage ELISA comme démontré.
Après le dernier lavage, ajoutez 100 microlitres d’anticorps secondaires dans un tampon de lavage ELISA à chaque puits pour une incubation d’une heure à 25 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, laver la plaque comme démontré et ajouter 100 microlitres de solution de TMB à chaque puits pour une incubation de 15 à 30 minutes à température ambiante. Lorsqu’une couleur bleue se développe, ajoutez 50 microlitres de solution d’arrêt à chaque puits et mesurez l’absorbance à 450 nanomètres.
Après la purification de la colonne d’exclusion de taille d’un surnageant de culture d’A.actinomycetemcomitans, comme démontré, deux pics lipidiques distincts ont été observés, correspondant aux grandes et petites vésicules de la membrane externe produites par cette souche. L’analyse ELISA des fractions de l’échantillon a révélé que la toxine est principalement associée à la sous-population de grandes vésicules de la membrane externe. L’analyse par immuno-transfert a donné des résultats similaires mais plus bruyants, indiquant que cette approche est moins sensible que l’ELISA.
Comme observé, cette technique de chromatographie est capable d’éliminer des quantités importantes de protéines libres des préparations des vésicules de la membrane externe. Cependant, il est important de noter que la concentration totale en protéines n’est pas nécessairement corrélée à la concentration de protéines spécifiques. Il est important d’être très prudent lors de l’emballage et du fonctionnement de la colonne pour éviter les bulles et éviter que la colonne ne se dessèche.
La diffusion dynamique de la lumière, le suivi des particules et la bicroscopie peuvent être effectués après une chromatographie d’exclusion de taille pour déterminer la taille et d’autres caractéristiques des vésicules de la membrane externe séparées.
