Ce travail a été financé par les Instituts nationaux de la santé Grant GM094246, l&#39;American Heart Association Grant 11GRNT7890004, et la National Science Foundation Grant MCB-1110501.

1 Créer la construction contenant la protéine d&#39;intérêt Cloner le gène exprimant la protéine d&#39;intérêt dans un vecteur approprié. Utilisation des vecteurs tels que la série ou pcDNA pRK5 comme ils sont bien adaptés pour l&#39;expression dans des systèmes de mammifères, comme les cellules HEK293 et ​​CHO. 2 Sélectionnez les sites sur la protéine à être associés avec les fluorophores <ol><li> Choisir des sites d&#39;étiquetage qui sont capables de réfléchir possibles changements conformationnels dans la protéine. Si possible, utiliser une structure cristalline de la protéine ou d&#39;une protéine homologue pour aider à faire cette détermination. S&#39;il n&#39;y a pas de structure de cristal disponible, utiliser un logiciel en ligne pour prédire la structure possible de la protéine et donc de recevoir un aperçu des sites appropriés. </li><li> Choisir les résidus tels que les chaînes latérales des résidus sont choisis surface exposée et accessible pour les fluorophores de sorte que la protéine peut être marquée. <ol><li> Choisir résidusne sont pas critiques pour la fonction des protéines, par exemple des sites qui ne sont pas impliquées dans la liaison du ligand. </li><li> Dans l&#39;introduction de la mutation de cysteine, donner la préférence à des sites qui sont similaires, par exemple la serine, qui pourraient causer une perturbation minimale de la structure de la protéine. </li><li> Après avoir choisi les sites de marquage, faire des mutations de sorte que la protéine ne donne LRET destinés à partir de ces sites. Utiliser des protocoles de mutagenèse dirigée standard pour muter loin cystéines non-liaison disulfure qui pourraient se lier à maléimide conjugués des marqueurs fluorescents. Ne pas muter loin cystéines liaison disulfure et enterrés, cystéines libres, car ils ne doivent pas réagir avec des colorants fluorescents dans la forme repliée de la protéine. </li></ol></li><li> Introduire les résidus de cysteine ​​dans les sites souhaités en faisant des mutations ponctuelles à l&#39;aide de protocoles de mutagenèse dirigée standard. </li><li> Inclure un site de clivage de la protéase qui peut cliver spécifiquement une des cystéines de la protéine. Si l&#39;séquence protéique permet, d&#39;introduire le site de la mutation conservative de la protéine à une thrombine (séquence de reconnaissance LVPRGS) ou le facteur Xa (IDGR de séquence de reconnaissance ou IEGR) à proximité de la séquence de cysteine ​​introduit et accessible au clivage de la protéase; autrement la séquence tétra-ou hexa-peptide peut être introduit dans son ensemble. Choisir le site de telle sorte que lors du clivage de l&#39;un des résidus cysteine ​​introduits dissocie du reste de la protéine dans certains cas, cela peut nécessiter deux sites de clivage flanquant une cystéine mutée. </li></ol> 3 Testez l&#39;expression et la fonctionnalité de la protéine <ol><li> Effectuer un transfert de Western pour confirmer l&#39;expression de la protéine mutée. </li><li> Effectuer un essai fonctionnel de la protéine de sorte que les mutations ont modifié la fonction de la protéine que très peu, voire pas du tout, d&#39;éviter l&#39;étude des changements conformationnels de la protéine dysfonctionnelle. NOTE: Depuis toutes les protéines ont des fonctions différentes, il n&#39;y a pas simple f<html> test unctional qui est utilisé spécifiquement pour LRET; cependant, quelques exemples de dosages comprennent les dosages enzymatiques fonctionnelles d&#39;activité pour des enzymes, des dosages de liaison de ligand pour des récepteurs, et des études électrophysiologiques de canaux ioniques. </li></ol> 4 Sélectionnez les fluorophores à être utilisé Sélectionnez fluorophores sur la base de la plage de distance devrait être mesurés tels que la gamme se situe entre 0.5-1x la R 0 de la paire de fluorophore. NOTE: Cela permet une soustraction plus facile de l&#39;arrière-plan, ce qui a généralement beaucoup plus longues durées de vie. Par exemple, si la plage de distance attendue mesurée est d&#39;environ 35 Å, une paire de fluorophore approprié d&#39;utiliser serait chélate de terbium comme donneur et Alexa 594 comme accepteur, parce que le R 0 pour cette paire est de 53 Å (tableau 1). 5. exprimer la protéine par transitoirement transfection de la quantité requise de cellules de mammifères ntent &quot;&gt; transfecter transitoirement la protéine d&#39;intérêt dans les cellules de mammifères choisis à l&#39;aide de l&#39;un des réactifs de transfection communes Typiquement, utilisez quatre plats de 10 cm par expérience de propagation à longue distance pour les lignées cellulaires HEK et CHO;. Toutefois, ce montant peut varier en fonction de l&#39;expression des protéines , la stabilité, etc. permettre aux cellules d&#39;exprimer la protéine de 36 à 48 heures avant la récolte. 6. Etiqueter les protéines <ol><li> Détacher les cellules de la boîte de culture. Détacher les cellules HEK par pipetage simplement tampon contre le fond de la boîte. Détacher les cellules CHO avec un racleur de cellules, de rincer les médias avec un tampon extracellulaire. </li><li> Recueillir les cellules par centrifugation à 1 100 g pendant 3 min. Utilisez les mêmes paramètres de centrifugeuses pour la collecte de cellules après l&#39;étiquetage, ainsi que, après les lavages suivants. </li><li> Suspendre les cellules dans 3 ml de tampon extracellulaire, puis ajouter les fluorophores donneur et accepteur dans des quantités équimolaires jusqu&#39;à une concentration finale de 100 à 300 nM. Incuber sur un agitateur fou 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver ces cellules marquées 3-4x avec un tampon extracellulaire de supprimer fluorophores non liés, puis suspendre ces cellules dans un tampon extracellulaire (généralement 2 ml) pour les mesures de lRet. </li><li> Comme contrôle, identifier un ensemble séparé de cellules avec seulement fluorophore donneur (chélate de terbium) sans addition d&#39;un quelconque fluorophore accepteur. REMARQUE: Les données de ces expériences donateurs seule est nécessaire de compléter l&#39;analyse. Ces expériences peuvent être réalisées sur les mêmes ou différents jours. </li><li> Encore une fois, procéder à la validation fonctionnelle, cette fois avec la protéine mutante marqué, comme le processus d&#39;étiquetage peut également interférer avec la fonction selon le site utilisé pour le marquage. NOTE: Ces expériences peuvent être réalisées sur les mêmes ou différents jours. </li></ol> 7 Mettre en place l&#39;expérience de propagation à longue distance <ol><li> Placer les cellules remises en suspension dans une cuve en quartz avec un volume minimum de 1 ml. </li><li> Allumez l&#39;ordinateur et l&#39;instrument et régler les paramètres de la datun programme d&#39;acquisition en conséquence. <ol><li> Régler la longueur d&#39;onde d&#39;excitation de la gamme d&#39;absorption du fluorophore donneur (330-340 nm fonctionne bien pour chélate de terbium). </li><li> Réglez la longueur d&#39;onde d&#39;émission de façon appropriée, en gardant à l&#39;esprit que l&#39;émission de l&#39;accepteur varie en fonction de l&#39;accepteur utilisé. Surtout, sélectionnez une longueur d&#39;onde de détection qui ne mesure que l&#39;émission de l&#39;accepteur et n&#39;inclut aucune purge travers de l&#39;émission du donneur. Par exemple, utiliser une longueur d&#39;onde de 565 nm pour Alexa 555 comme accepteur Tableau 1. Pour les mesures de donateurs seule, dans laquelle la protéine a été marquée uniquement par le donneur, mais sans accepteur, utiliser une longueur d&#39;onde de 545 nm pour la mesure de terbium chélate émission. </li><li> Réglez la longueur de la détection d&#39;émission soit au moins trois fois la durée de vie de LRET attendu à ce que des mesures à long durée de vie ne sera pas manquée. </li></ol></li><li> Effectuer l&#39;analyse. Ne au moins trois scans de 99 balayages pour assurer la cohérence des résultats. Enregistrer eRésultats de la e sous forme de fichier texte (* txt). </li><li> Pour mesurer les changements de conformation d&#39;une protéine à l&#39;égard de différentes conditions (comme l&#39;ajout d&#39;un ligand), modifier ces conditions et effectuer à nouveau au moins trois scans de 99 balayages chacun sur le même échantillon dans cette nouvelle condition. Si l&#39;étude des effets du glutamate sur la conformation des récepteurs du glutamate, par exemple, ajouter glutamate à 1 mM dans le même échantillon numérisé à l&#39;étape 7.3, puis relancez la numérisation. </li><li> Ajouter jusqu&#39;à cinq unités de la protéase appropriée et prendre analyses continuellement jusqu&#39;à ce que le clivage est terminée et aucun autre changement est vu dans la vie de trois balayages successifs. Habituellement, le clivage est complet en deux à trois heures. Si un Xa site de clivage du facteur est utilisé pour clivage de la protéase, par exemple, ajouter 3 pi de facteur Xa à l&#39;échantillon, et de numériser toutes les 30 minutes pendant 3 heures. </li></ol> 8 Analyser les données obtenues <ol><li> Ouvrir le logiciel d&#39;analyse de données. </li><li> Chargez la durée de vie de fluorescencedonnées à l&#39;aide d&#39;importation ASCII pour ouvrir les fichiers texte. Charger toutes les répétitions ainsi que les dernières mesures de fond, en un seul fichier. </li><li> La moyenne des données de toutes les analyses pour chaque condition expérimentale pour obtenir les données finales. Pour ce faire, sélectionnez les colonnes qui contiennent les essais individuels, puis sous le menu Données dans la barre de menu, cliquez sur Statistiques sur les lignes pour afficher les intensités moyennes de fluorescence des essais, ainsi que l&#39;écart type et l&#39;erreur-type. </li><li> Tracer les valeurs moyennes en tant que graphique linéaire avec l&#39;intensité de fluorescence sur l&#39;axe des ordonnées et la durée de vie en microsecondes sur l&#39;axe des X pour créer une courbe qui représente la durée de vie de l&#39;émission sensibilisée de l&#39;accepteur. Changer l&#39;axe Y de la parcelle à une échelle logarithmique, pour permettre une meilleure visualisation des données. </li><li> Répétez l&#39;étape 8.3 sur les données de mesure de référence, la moyenne des balayages finaux qui montrent un chevauchement indiquant le clivage complet. </li><li> Afficher les données de base sur la moyennemême parcelle qui contient les données brutes en moyenne. Pour ce faire, ouvrez la boîte de dialogue Contrôle des couches se trouve sous le menu Plot. Ensuite, transférez les données contenant le fond signifie dans la liste des matières de la couche. </li><li> Alignez les données de base moyenne des données brutes moyennes. Pour ce faire, utilisez la fonction mathématique simple dans le menu Math pour multiplier ou diviser les données de base selon les besoins jusqu&#39;à la fin de la queue de l&#39;arrière-plan se superpose à la fin de la queue des données brutes. NOTE: En cette fin de queue, la durée de vie de la protéine d&#39;intérêt aurait déjà complètement décru à; ce qui est alignée sur le fond est simplement le signal présent à la fois avant et après clivage par la protéase. </li><li> Soustraire le signal de fond aligné à partir du signal initial de LRET brut, de nouveau en utilisant la fonction mathématique simple. </li><li> Monter les données à une décroissance exponentielle (exponentielles simples ou multiples, selon les sites et la conception expérimentale). <ol><li> Réglez la limite de début de mise en place pour commencer après la finde l&#39;impulsion laser. Utilisez cette même startpoint pour tous les accessoires de la courbe ultérieures. </li><li> Dans la boîte de dialogue de fonction d&#39;ajustement Choisir, sélectionnez décroissance exponentielle de manière à s&#39;adapter à la vie à l&#39;équation suivante pour une seule décroissance exponentielle: <img alt="Equation 4" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq4.jpg" width="200" /> Eq. 4 où y représente l&#39;intensité de fluorescence, y 0 représente l&#39;intensité d&#39;arrière-plan en raison du bruit du système, A 1 est l&#39;intensité du signal, t est la durée de vie de fluorescence, x est le temps, et x 0 est le décalage de temps. </li><li> Fixer X 0 à 0, commencer la fonction d&#39;ajustement, et ajuster les données. REMARQUE: Si l&#39;expérience est conçue pour avoir uniquement des signaux provenant d&#39;une paire de sites, les données obtenues devraient facilement être adapté par une seule décroissance exponentielle 8. Le résidu de l&#39;ajustement est une bonne méthode pour déterminer la qualité de l&#39;ajustement et si la durée de vie de décroissance supplémentaires sont requiréd. </li></ol></li><li> Utiliser les durées de vie obtenues à partir des données pour calculer la distance entre les fluorophores à l&#39;aide de l&#39;équation de Förster (un réarrangement des équations 1 et 2 ci-dessus): <img alt="Equation 5" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq5.jpg" width="200" /> Eq. 5 NOTE: Toutes les variables sont comme mentionné ci-dessus avec τ DA ayant été mesurée comme la durée de vie accepteur d&#39;émission sensibilisée. De plus amples détails et des exemples sur les mesures de R 0 et R peuvent être trouvés ailleurs 7,9,10. </li><li> Recommencer l&#39;expérience et l&#39;analyse de données d&#39;au moins trois fois pour assurer la reproductibilité. Incohérence entre les répétitions individuelles de la même mesure remet en question la validité des données; utiliser des expériences de contrôle supplémentaires ou des répétitions. Calculer les erreurs de mesure grâce à la connexion Gustave analyse d&#39;erreur calculatrice (mis au point par le Dr Thomas Huber) ou un système similaire qui se propage l&#39;erreur dans lecrises de la vie. </li></ol>

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	<li>Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+biophysical+applications+of+lanthanide-based+probes.">Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).</li><li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer:+a+spectroscopic+ruler.">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 719-726 (1967).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler.">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).</li><li>Selvin, P. R., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+energy+transfer+using+a+terbium+chelate:+improvements+on+fluorescence+energy+transfer.">Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10024-10028 (1994).</li><li>Chen, J., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+luminescent+chelates+of+terbium+and+europium.">Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium.</a> Bioconjugate Chemistry. 10, 311-315 (1999).</li><li>Ge, P., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+luminescent+lanthanide+chelates:+part+2.">Thiol-reactive luminescent lanthanide chelates: part 2.</a> Bioconjugate Chemistry. 14, 870-876 (2003).</li><li>Gonzalez, J., Rambhadran, A., Du, M., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRET+investigations+of+conformational+changes+in+the+ligand+binding+domain+of+a+functional+AMPA+receptor.">LRET investigations of conformational changes in the ligand binding domain of a functional AMPA receptor.</a> Biochemistry. 47, 10027-10032 (2008).</li><li>Ramaswamy, S. S., Maclean, D. M., Gorfe, A. A., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+mediated+conformational+changes+in+an+Acid+Sensing+Ion+Channel.">Proton mediated conformational changes in an Acid Sensing Ion Channel.</a> J. Bio. Chem. 288, (2013).</li><li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+at+the+agonist+binding+domain+of+the+N-methyl-D-aspartic+acid+receptor.">Conformational changes at the agonist binding domain of the N-methyl-D-aspartic acid receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 16953-16957 (2011).</li><li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+arrangement+in+N-methyl-D-aspartate+(NMDA)+receptors.">Subunit arrangement in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 15296-15301 (2010).</li><li>Kokko, T., Kokko, L., Soukka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terbium(III)+chelate+as+an+efficient+donor+for+multiple-wavelength+fluorescent+acceptors.">Terbium(III) chelate as an efficient donor for multiple-wavelength fluorescent acceptors.</a> Journal of Fluorescence. 19, 159-164 (2009).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

LRET est une technique puissante qui permet aux scientifiques de mesurer des distances entre des domaines au sein d&#39;une seule protéine, ainsi qu&#39;entre les sous-unités d&#39;une protéine multimérique. En tant que tel, LRET est bien adapté à l&#39;examen des changements de conformation et la dynamique des protéines ou d&#39;autres macromolécules. Le protocole ci-dessus devrait permettre au laboratoire bien équipé pour tester facilement leurs hypothèses; Cependant, il existe de nombreuses sources d&#39;e...

Transfert Luminescence Resonance Energy (LRET) est un dérivé de la technique 1 bien connu Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Similaires à FRET, LRET peut être utilisé pour mesurer les distances et les changements de distance entre les fluorophores donneur et accepteur attachés à des sites spécifiques sur la protéine d&#39;intérêt dans la plage de 10 à 100 Å 3.1. Les principes de la LRET sont également similaires à FRET en ce que le transfert d&#39;énergie de résonance se produit entre les deux fluorophores proximales quand le spectre d&#39;émission du fluorophore donneur chevauche le spectre du fluorophore accepteur d&#39;absorption. L&#39;efficacité de ce transfert est liée à la distance entre les deux fluorophores par l&#39;équation suivante: <img alt="L&#39;équation 1" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq1.jpg" width="120" /> Eq. 1 où R est la distance entre les deux fluorophores, E est l&#39;efficacité de salleéner- transfert, et R 0, discuté ci-dessous, est le rayon de Förster pour la paire de fluorophore, c&#39;est à dire la distance à laquelle l&#39;efficacité de transfert est semi-maximale. A partir de cette équation, on peut voir que l&#39;efficacité est liée à la grandeur de la distance élevée à la puissance six inverse 1. C&#39;est cette sixième dépendance de la puissance inverse qui permet de FRET et les mesures de lRet être extrêmement sensible, même à de faibles variations de distance quand près de la R 0 de la paire FRET. La capacité d&#39;étiqueter les sites désirés sur des protéines ou d&#39;autres macromolécules permet de prendre avantage de cette sensibilité pour surveiller les changements de conformation. Par rapport à FRET, qui utilise des molécules classiques de colorants organiques, LRET offre des avantages supplémentaires. Dans LRET, au lieu d&#39;utiliser un colorant organique comme le fluorophore donneur, un cation de la série des lanthanides, typiquement Tb 3 + ou Eu 3 +, on utilise 1,4-6. Fluorophores u tombentelon cette catégorie, par exemple, un chelate de terbium, sont également très polyvalent en ce qu &#39;ils peuvent être utilisés avec une large gamme de fluorophores accepteurs. Cette flexibilité est rendue possible parce que les spectres d&#39;émission des lanthanides chélatés contient de multiples pics d&#39;émission tranchants, ce qui permet une seule espèce de fluorophore donneur pour être utilisé avec une grande variété de fluorophores accepteurs. Ainsi, l&#39;émission de l&#39;accepteur sensibilisés peut être détectée sans aucune crainte de contamination purge par du donneur émission 5. L&#39;expérimentateur choisit l&#39;accepteur spécifique sur la base de la distance attendue entre les deux fluorophores (Figure 1 et Tableau 1). Dans ces fluorophores lanthanides chélatés, l&#39;ion métallique est chélaté par une molécule qui contient un groupe d&#39;antennes qui sensibilise le lanthanide normalement peu absorbant à l&#39;excitation ainsi qu&#39;un groupe fonctionnel bioréactif pour attacher l&#39;ion à un groupe fonctionnel spécifique de la macromolécule 1, 5,6. Once excité, lanthanides se détendre à l&#39;état du sol par la libération de photons avec un taux de décroissance de l&#39;ordre de la milliseconde. Parce que la décroissance n&#39;est ni une relaxation singulet à singlet ni un triplet de détente à singulet, l&#39;émission de photons peut pas correctement être appelé fluorescence ou phosphorescence, mais il est plus correct appelé luminescence 1. La longue décadence de lanthanides luminescence contribue grandement à des mesures de durée de vie. Les mesures de durée de vie peuvent ensuite être utilisées pour déterminer l&#39;efficacité par la relation suivante: <img alt="Equation 2" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq2.jpg" width="120" /> Eq. 2 où E est l&#39;efficacité du transfert, τ D est la durée de vie du donneur (lanthanide chélaté) lorsque ne participant pas au transfert d&#39;énergie, et τ DA est la durée de vie du donneur en participant à un transfert d&#39;énergie de l&#39;accepteur. Avec LRET, τ DA peut aldonc être mesurée par la durée de vie de l&#39;émission de l&#39;accepteur sensibilisés parce que la durée de vie de terbium est d&#39;autant plus grande qu&#39;un fluorophore accepteur organique. L&#39;accepteur émet avec la même durée de vie que son incitation excitation (donneur lanthanides), et une contribution à la vie de la propre vie de fluorescence intrinsèque de l&#39;accepteur est relativement négligeable. En mesurant l&#39;émission sensibilisés plutôt que l&#39;émission des bailleurs de fonds, nous éliminons également la nécessité de garantir un étiquetage exactement un ratio de 1: 1 de donneur à accepteur. Les protéines peuvent être étiquetés au lieu simultanément avec les deux accepteur et fluorophores donneurs. Une population hétérogène marqué va entraîner, mais protéines marquées double donateurs n&#39;émettra pas dans la longueur d&#39;onde de l&#39;accepteur et protéines marquées double-accepteur ne sera pas excité. En outre, la distance entre fluorophores devrait être la même, quelle que soit la cystéine place un fluorophore donné attache à, en particulier lors de l&#39;utilisation des lanthanides isotropes comme un donneur, de sorte que le need pour spécifier un site donné pour recevoir soit le donneur ou accepteur est inutile. Intensité peut être affectée avec une population hétérogène, mais doit encore être plus que suffisant pour être détecté. Lors de la planification d&#39;expériences, le choix des fluorophores doit être dicté par la valeur de R 0 de la paire ainsi que la plage de distance étant mesurée attendue. La valeur de R 0 est défini par l&#39;équation suivante: <img alt="Équation 3" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq3.jpg" width="250" /> Eq. 3 où, R 0 est le rayon de Förster en angströms, κ 2 est le facteur d&#39;orientation entre les deux colorants (généralement supposés être 2/3), φ D est le rendement quantique du donneur, J est le chevauchement spectral intégrale entre le donateur spectre d&#39;émission et le spectre d&#39;absorption de l&#39;accepteur à M - 1cm -1 nm 4, et n est l&#39;indice de réfraction du milieu 1. Notre laboratoire a ajouté une modification de la technique de la LRET classique par introduction d&#39;un site de reconnaissance de protéase entre les sites donneurs et accepteurs d&#39;étiquettes sur la protéine est sondé. Cette modification permet d&#39;investigation dans les systèmes non purifiés tels que les cellules de mammifères entiers 7. Cette technique est particulièrement utile lors de l&#39;utilisation en tant que sites cystéines pour l&#39;étiquetage, étant donné que dans le procédé de marquage avec des colorants de maléimide conjugués qui se lient à des groupes sulfhydryle de cystéine, d&#39;autres protéines sur les cellules qui possèdent des résidus cysteine ​​sont aussi marquées. Toutefois, en incluant des sites de clivage de la protéase de la protéine d&#39;intérêt et la mesure des durées de vie avant et après clivage, l&#39;expérimentateur peut quantitativement soustraire le signal d&#39;arrière-plan après le clivage de la protéase à partir du signal brut. Cette soustraction isole le signal spécifique découlant de la protéine d&#39;intérêt (figureure 2). Utilisation de la modification décrite ci-dessus, LRET peut être utilisé pour mesurer les changements de distance entre le donneur de chélate de terbium, et la sonde à un accepteur de la protéine, et ainsi de surveiller les changements de conformation de l&#39;état physiologique à proximité de la protéine sans la nécessité d&#39;une purification. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1.Le spectres d&#39;absorption et d&#39;émission de terbium chélaté en noir, ainsi que d&#39;un accepteur représentant, Alexa 488, en rouge. Notez les multiples pics d&#39;émission et la forte, la gamme d&#39;émission étroit pour chaque pic de terbium chélate. Ce schéma permet de terbium à être utilisé avec une variété de fluorophores accepteurs et facilite la mesure de l&#39;émission sensibilisée à l&#39;intérieur de ces gammes, où le terbium montre pas d&#39;émission. Le pic d&#39;émission de terbium à 486 nm recouvre assez bien avec l&#39;un<html> bsorption pic de l&#39;Alexa 488, ce qui permet un transfert d&#39;énergie de résonance de se produire entre les deux fluorophores. Une longueur d&#39;onde de 515 nm est un excellent choix pour détecter l&#39;émission sensibilisée pour cette paire comme il est dans la vallée entre les pics d&#39;émission de terbium, et tout près de Alexa 488 émissions pic de 520 nm. Notez que pour près de la pointe de l&#39;accepteur, bien que souhaitable, n&#39;est pas nécessaire-565 nm est encore capable de détecter Alexa 488 émissions sans détecter aussi terbium émission. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="374"><tbody><tr height="27"><td height="27" style="height:27px;width:147px;"> Fluorophore accepteur </td><td style="width:45px;"> R 0 (Å) </td><td style="width:183px;"> longueur d&#39;onde d&#39;émission (nm) </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;width:147px;"> Atto 465 </td><td align="right" style="width:45px;"> 36 </td>3px; &quot;&gt; 508 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Fluorescéine </td><td align="right" style="width:45px;"> 45 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 488 </td><td align="right" style="width:45px;"> 46 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 680 </td><td align="right" style="width:45px;"> 52 </td><td align="right" style="width:183px;"> 700 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 594 </td><td align="right" style="width:45px;"> 53 </td><td align="right" style="width:183px;"> 630 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 555 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 565 </td></tr><trheight = &quot;22&quot;&gt; <td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Cy3 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 575 </td></tr></tbody></table> Tableau 1 La liste des fluorophores accepteurs couramment utilisés pour LRET utilisant terbium chélate comme donneur 11. Les valeurs de R 0 sont mesurées lorsque le donneur et accepteur sont liés au domaine de liaison de l&#39;agoniste des récepteurs AMPA soluble. Il est idéal pour mesurer la valeur R 0 nouveau pour chaque nouveau système étudié. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2: Une vue d&#39;ensemble de la méthode de propagation à longue distance présenté. (A) Le récepteur AMPA est une protéine de membrane qui subit des changements conformationnels sur liaison de ligand. Le ligand bi-coque en forme dedomaine nding est entouré ici en rouge. (B) Le domaine de liaison au ligand de l&#39;AMPA lorsqu&#39;il n&#39;est pas lié à la protéine existe dans une conformation ouverte (à gauche). Lorsqu&#39;il est lié à un ligand glutamate, la protéine se ferme autour de son ligand (à droite). En plaçant des fluorophores dans les sites probants sur le LBD, la nature de ce changement de conformation peut être considérée comme la distance entre les fluorophores modifications, qui seront ensuite affecter la durée de vie de fluorescence. (C) Lorsque des cellules entières d&#39;étiquetage, de marquage à la fois la protéine d&#39;intérêt ainsi que les protéines de la membrane de fond peut se produire (à gauche). Après clivage de la protéase, le signal LRET de la protéine d&#39;intérêt va disparaître en raison de la libération d&#39;un fragment soluble, laissant intact le signal de fond (à droite). Ce signal d&#39;arrière-plan peut alors être soustraite du signal brut.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1394">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:693px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PV3579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F-150</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10254</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20346</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10256</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20344</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">QuantaMaster 3-SS</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the ms range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">FluoreScan 2.0</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Origin 8.6</td>
			<td style="width:223px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Quartz Cuvette</td>
			<td style="width:223px;">Starna Cells, Inc</td>
			<td style="width:119px;">3-Q-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Stir Bar&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Bel-Art Products</td>
			<td style="width:119px;">F37119-0007</td>
			<td>Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence resonance energy transfer to study conformational changes in membrane proteins expressed in mammalian cells

Transfert Luminescence Resonance Energy, ou LRET, est une technique puissante utilisée pour mesurer les distances entre deux sites dans les protéines dans la plage de distance de 10-100 Å. En mesurant les distances dans diverses conditions ligaturées, des changements conformationnels de la protéine peuvent être facilement évalués. Avec LRET, un lanthanide, le terbium plus souvent chélaté, est utilisé comme fluorophore donneur, offrant des avantages comme une durée de vie prolongée des donateurs seule émission, la possibilité d&#39;utiliser plusieurs fluorophores accepteurs, et la possibilité de détecter sensibilisés émission accepteur comme un moyen facile pour mesurer le transfert d&#39;énergie sans risque de détecter également le signal de donateurs seulement. Ici, nous décrivons une méthode pour utiliser LRET de protéines membranaires exprimés et testés sur la surface de cellules de mammifères intacts. Nous introduisons un site de clivage de protéase entre la paire de fluorophore LRET. Après l&#39;obtention du signal d&#39;origine LRET, le clivage en ce site élimine le signal de LRET spécifique de la protéine deintérêt qui nous permet de soustraire quantitativement le signal de fond qui reste après clivage. Cette méthode permet de plus physiologiquement mesures appropriées pour y être apportées sans la nécessité de purification de protéine.

Une mesure de la LRET succès avec un donneur de lanthanide doit avoir une durée de vie que donneur dans la plage de temps en millisecondes. La durée de vie d&#39;émission de LRET sensibilisée pour la protéine marqué avec le donneur et l&#39;accepteur seront notablement plus courte, avec une durée de vie de l&#39;ordre de la microseconde après soustraction de fond Figure 3. Protéase résultats de clivage par une augmentation de la durée de vie qui doit devenir stable dans le temps ( c&#39;...

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Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Nous décrivons ici une méthode améliorée Transfert Luminescence Resonance Energy (LRET) où nous introduisons un site de clivage de protéase entre les sites de fluorophores donneur et accepteur. Cette modification permet d&#39;obtenir des signaux de LRET spécifiques découlant de protéines membranaires d&#39;intérêt, ce qui permet l&#39;étude de protéines de la membrane sans la purification des protéines.

Luminescence Resonance Energy Transfer pour étudier les changements conformationnels dans des protéines membranaires exprimés dans les cellules de mammifères

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.9K vues.  University of Texas Health Science Center at Houston.  Nous décrivons ici une méthode améliorée Transfert Luminescence Resonance Energy (LRET) où nous introduisons un site de clivage de protéase entre les sites de fluorophores donneur et accepteur. Cette modification permet d'obtenir des signaux de LRET spécifiques découlant de protéines membranaires d'intérêt, ce qui permet l'étude de protéines de la membrane sans la purification des protéines. 

Vidéo: Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural biology 1. In recent years, this method has achieved great success in studying structures of proteins and macromolecular complexes 2, 3. Compared with electron cryomicroscopy (cryoEM), in which frozen hydrated protein samples are embedded in a thin layer of vitreous ice 4, negative staining is a simpler sample preparation method in which protein samples are embedded in a thin layer of dried heavy metal salt to increase specimen contrast 5. The enhanced contrast of negative stain EM allows examination of relatively small biological samples. In addition to determining three-dimensional (3D) structure of purified proteins or protein complexes 6, this method can be used for much broader purposes. For example, negative stain EM can be easily used to visualize purified protein samples, obtaining information such as homogeneity/heterogeneity of the sample, formation of protein complexes or large assemblies, or simply to evaluate the quality of a protein preparation.
In this video article, we present a complete protocol for using an EM to observe negatively stained protein sample, from preparing carbon coated grids for negative stain EM to acquiring images of negatively stained sample in an electron microscope operated at 120kV accelerating voltage. These protocols have been used in our laboratory routinely and can be easily followed by novice users.

Visualizing protein samples by negative stain electron microscopy (EM) has become a popular structural analysis method. It is useful for quantitative structural analysis, such as calculating a 3D reconstruction of the molecules being studied, and also for qualitative examination of the quality of protein preparations. In this article we present detailed protocols for preparing the EM grids, staining the sample and visualizing the sample in an electron microscope. Novice users can follow these protocols easily and to utilize negative stain EM as a routine assay, in addition to other biochemical assays, for evaluating their protein samples.

Visualisation protéines et de complexes macromoléculaires par EM négatif Tache: de la préparation de grille pour l&#39;acquisition d&#39;images

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Recherche

Bio-ingénierie

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key component of lung development is the differentiation of alveolar type II epithelial cells, the major source of pulmonary surfactant. These cells also participate in fluid homeostasis in the alveolar lumen, host defense, and injury repair. In addition, distal lung parenchyma cells can be directly exposed to exaggerated stretch during mechanical ventilation after birth. However, the precise molecular and cellular mechanisms by which lung cells sense mechanical stimuli to influence lung development and to promote lung injury are not completely understood. Here, we provide a simple and high purity method to isolate type II cells and fibroblasts from rodent fetal lungs. Then, we describe an in vitro system, The Flexcell Strain Unit, to provide mechanical stimulation to fetal cells, simulating mechanical forces in fetal lung development or lung injury. This experimental system provides an excellent tool to investigate molecular and cellular mechanisms in fetal lung cells exposed to stretch. Using this approach, our laboratory has identified several receptors and signaling proteins that participate in mechanotransduction in fetal lung development and lung injury.

Mechanical forces play a key role in lung development and lung injury. Here, we describe a method to isolate rodent fetal lung type II epithelial cells and fibroblasts and to expose them to mechanical stimulation using an in vitro system.

Un système expérimental pour étudier mécanotransduction dans les cellules des poumons du foetus

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein activity and have diverse roles in many biological processes. For example, SUMO covalently modifies a large number or proteins with important roles in many cellular processes, including cell-cycle regulation, cell survival and death, DNA damage response, and stress response 1-5. SENP, as SUMO-specific protease, functions as an endopeptidase in the maturation of SUMO precursors or as an isopeptidase to remove SUMO from its target proteins and refresh the SUMOylation cycle 1,3,6,7.
The catalytic efficiency or specificity of an enzyme is best characterized by the ratio of the kinetic constants, kcat/KM. In several studies, the kinetic parameters of SUMO-SENP pairs have been determined by various methods, including polyacrylamide gel-based western-blot, radioactive-labeled substrate, fluorescent compound or protein labeled substrate 8-13. However, the polyacrylamide-gel-based techniques, which used the "native" proteins but are laborious and technically demanding, that do not readily lend themselves to detailed quantitative analysis. The obtained kcat/KM from studies using tetrapeptides or proteins with an ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) or AMC (7-amino-4-methylcoumarin) fluorophore were either up to two orders of magnitude lower than the natural substrates or cannot clearly differentiate the iso- and endopeptidase activities of SENPs.
Recently, FRET-based protease assays were used to study the deubiquitinating enzymes (DUBs) or SENPs with the FRET pair of cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP) 9,10,14,15. The ratio of acceptor emission to donor emission was used as the quantitative parameter for FRET signal monitor for protease activity determination. However, this method ignored signal cross-contaminations at the acceptor and donor emission wavelengths by acceptor and donor self-fluorescence and thus was not accurate.
We developed a novel highly sensitive and quantitative FRET-based protease assay for determining the kinetic parameters of pre-SUMO1 maturation by SENP1. An engineered FRET pair CyPet and YPet with significantly improved FRET efficiency and fluorescence quantum yield, were used to generate the CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substrate 16. We differentiated and quantified absolute fluorescence signals contributed by the donor and acceptor and FRET at the acceptor and emission wavelengths, respectively. The value of kcat/KM was obtained as (3.2 &plusmn; 0.55) x107 M-1s-1 of SENP1 toward pre-SUMO1, which is in agreement with general enzymatic kinetic parameters. Therefore, this methodology is valid and can be used as a general approach to characterize other proteases as well.

Quantitative FRET F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

A novel method involving quantitative analysis of FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer) signals is described for studying enzyme kinetics. KM and kcat were obtained for the hydrolysis of the catalytic domain of SENP1 (SUMO/Sentrin specific protease 1) to pre-SUMO1 (Small Ubiquitin-like MOdifier). The general principles of this quantitative-FRET-based protease kinetic study can be applied to other proteases.

Quantitative FRET (transfert de Förster Resonance Energy) Analyse de la protéase SENP1 Kinetics Détermination

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

Membrane-SPINE: un outil biochimique pour identifier les interactions protéine-protéine de protéines membranaires<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Un protocole pour l&#39;utilisation Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force biocapteurs pour mesurer les forces mécaniques à travers le complexe nucléaire LINC

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Faire fondre électrofilage écrit d’échafaudages Poly(ε-caprolactone) en trois dimensions avec des Morphologies contrôlables pour les Applications de génie tissulaire

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Culture de cellules mammifères dans les échafaudages de Peptide en trois dimensions

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

Une orbitale secouant la Culture des cellules de mammifères dans les vaisseaux en forme de O pour produire des agrégats uniformes

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Caractérisation des changements conformationnels à molécule unique sous le flux de cisaillement avec microscopie fluorescence

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Génération de conditions environnementales dynamiques à l’aide d’un dispositif microfluidique à haut débit

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...