Notre protocole fournit un flux de travail simplifié pour streptomyces venezuelae transcription-traduction sans cellule. Notre système exploite les enzymes métaboliques et les voies de cet organisme non modèle. Les principaux avantages sont l’expression hétérologue de gènes à haute teneur en GC, la fourniture d’un environnement favorable à l’acheminement des protéines et un système ouvert pour affiner les voies biosynthétiques.
Notre méthode ouvrira de nouvelles opportunités dans l’étude des streptomyces et des bactéries à GC élevé associées. Il permet d’étudier les enzymes et l’expression des gènes dans ces bactéries. Cette technique a été développée pour faciliter la mise en œuvre par les nouveaux utilisateurs.
La seule étape qui nécessite une expérience préalable ou une familiarisation est la sonication pour produire des extraits bruts hautement actifs. Pour commencer à récolter les cellules pré-cultivées le troisième jour, diluez la culture de nuit dans un rapport de un pour 10 avec un milieu GYN frais pour la mesure de la densité optique ou de l’OD à 600 nanomètres. Si la DO de la culture à 600 nanomètres est inférieure à 0,3, augmentez la vitesse d’agitation à 250 à 300 rotations par minute et augmentez jusqu’à ce qu’une OD atteigne 0,3.
Ne poussez pas plus de deux heures supplémentaires. Si la DO est supérieure à 0,3, transférer les cultures dans des récipients de centrifugation et refroidir rapidement sur de la glace humide pendant 30 minutes. En attendant que la culture cellulaire refroidisse, préparez quatre millilitres de tampons frais de dithiothréitol, S30A et S30B d’une molaire et conservez-les sur la glace.
Après avoir pesé un tube de centrifugeuse vide de 50 millilitres, pré-refroidissez-le à moins 20 degrés Celsius. Ajouter deux millilitres d’une molaire dithiothréitol à un litre de tampon S30A sur la glace et bien mélanger. Centrifugez les cellules à 6 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Après avoir éliminé le surnageant dans un mouvement rapide, ajoutez 250 millilitres de tampon S30A et remettez en suspension les cellules en secouant vigoureusement les bouteilles de centrifugation jusqu’à ce que les amas cellulaires soient dispersés de manière homogène. Ensuite, centrifugez à nouveau les cellules pendant six minutes. Après centrifugation, jeter le surnageant et répéter l’ajout de tampon S30A, suivi de la centrifugation comme démontré.
Ensuite, ajoutez deux millilitres d’une molaire DTT à un litre de tampon S30B sur la glace et mélangez bien. Ajouter 250 millilitres de tampon S30B aux cellules et répéter la centrifugation. Remettez en suspension la pastille de cellule dans 10 millilitres de tampon S30B et transférez la suspension de la cellule dans le tube de centrifugeuse pré-pesé pré-refroidi de 50 millilitres.
Si nécessaire, transférez les cellules résiduelles avec cinq à 10 millilitres supplémentaires de tampon S30B et remplissez le tube à un volume de 50 millilitres avec S30B. Centrifugez les cellules pendant 10 minutes. Jetez le surnageant et répétez la centrifugation aux réglages précédents comme démontré.
Après avoir jeté le surnageant, aspirez le surnageant S30B restant avec une pipette de 100 à 200 microlitres et pesez la pastille de cellule humide. Pour chaque gramme de cellules humides, ajoutez 0,9 millilitre de tampon S30B. Remettez en suspension les cellules à l’aide d’une pipette Pasteur ou d’un vortex.
Centrifuger brièvement pendant environ 10 secondes jusqu’à 500 G pour sédimenter les cellules. Abaissez la pointe du sonicateur dans la suspension de la cellule jusqu’à ce que la pointe soit à environ un centimètre sous la surface du liquide. Entrez différents paramètres dans les paramètres du sonicator.
Réglez la fréquence à 20 kilohertz, l’amplitude à 65% du temps d’activation et d’arrêt de l’impulsion à 10 secondes et le temps total de sonication à une minute. Commencez la sonication et déplacez le tube vers le haut ou vers le bas et latéralement pendant les deux premiers cycles de repos pour vous assurer que les cellules sont soniquées uniformément. Si les cellules ne sont pas complètement lysées, inverser le tube deux à trois fois et répéter la sonication pendant un ou deux cycles supplémentaires de 10 secondes avec un mélange fréquent jusqu’à ce que les cellules soient complètement perturbées.
Centrifugez les cellules lysées pour éliminer les débris cellulaires, puis transférez le surnageant dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre sous forme d’aliquote millilitre. Pour la réaction de ruissellement des extraits cellulaires, incuber la cellule contenant l’extrait cellulaire à 30 degrés Celsius pendant 60 minutes sur un bloc thermique ou dans l’incubateur sans agitateur. Pour la réaction transcription-traduction, décongeler l’extrait cellulaire SMM ou la solution MES et l’ADN plasmidique sur la glace.
Pré-refroidir une plaque de 384 puits à moins 20 degrés Celsius. Mettre en place la réaction transcription-traduction sur la glace où 25% du volume est de l’ADN plasmidique, 33,33% est de l’extrait cellulaire et 41,67% est une solution de SMM. Vaporisez doucement le mélange pendant environ cinq secondes à basse vitesse pour vous assurer que la solution est homogène tout en évitant la formation de mousse ou de bulles.
Transférer trois aliquotes de 10 microlitres dans trois puits d’une plaque de 384 puits comme un triplicate technique sans introduire de bulles d’air. Après avoir scellé la plaque avec un couvercle transparent, faites tourner la plaque à 400 fois G pendant cinq secondes et incubez la réaction à 28 degrés Celsius dans un incubateur ou un lecteur de plaque sans secouer. La transcription-traduction sans cellules de Streptomyces venezuelae a été optimisée pour l’expression à haut rendement des protéines fluorescentes du plasmide standard pTU1-A-SP44, ainsi que des enzymes biosynthétiques détectées par électrophorèse sur gel.
L’expression du plasmide étalon pTU1-A-SP44-mScarlet-I a été mesurée à l’aide de plusieurs méthodes. Les mesures de fluorescence en temps réel de l’ARNm à l’aide de l’aptamère d’ARN dBroccoli, de la protéine mScarlet-I immature à l’aide du système de marquage FlAsH et de la protéine mScarlet-I mature ont été effectuées. La coloration par fluorescence dans le gel de mScarlet-I à l’aide de la balise FlAsH a été réalisée en plus de la coloration Coomassie Blue de la protéine totale sans cellules.
Après cette procédure, des tests d’activité peuvent être effectués pour étudier les enzymes et les voies qui sont difficiles en utilisant des méthodes standard. Il s’étend également à la biosynthèse à grande échelle et à l’expression génique à haut débit. Nous développons cette technique pour étudier les enzymes métaboliques des bactéries à GC élevé.
Nous avons montré le potentiel de notre système pour étudier la biosynthèse à grande échelle dans les réactions sans cellules.
