Notre protocole décrit comment des techniques telles que la chromatographie analytique d’exclusion de la taille, l’ultracentrifugation analytique et le test de chaperonnage des histones pourraient être utilisées pour confirmer si une protéine est un chaperon d’histones. Les techniques abordées ici, lors de l’utilisation du tandem, pourraient être appliquées directement pour caractériser un chaperon putatif. Il pourrait aller de pair avec la technique de biologie structurale.
Les techniques sont applicables au domaine de la recherche sur la chromatine. Cependant, les méthodes individuelles pourraient être appliquées à toute autre protéine d’intérêt, au besoin. M. Surajit Gandhi, un étudiant au doctorat de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure pour le test de descente compliqué;
Archana Samal, doctorant, avec M. Ruchir C.Bobde pour l’expérience analytique d’ultracentrifugation;M. Somanath Baral, doctorant;avec M.Ketul Saharan pour le test de super-enroulement plasmidique Tout d’abord, mélanger des chaperons d’histones à cinq micromolaires avec des dimères H2A/H2B à 20 micromolaires dans 300 microlitres de tampon d’équilibre. Centrifuger le complexe H2A/H2B du chaperon d’histones pour éliminer tout précipité.
Chargez l’échantillon sur la colonne de spin pré-équilibrée avec un tampon d’équilibre. Lavez la colonne avec 100 volumes de colonne ou quatre millilitres de tampon de lavage pour éliminer l’excès de dimère H2A/H2B. Ensuite, mélangez le chaperon d’histones H2A/H2B avec du tétramère H3/H4 de 20 à 60 micromolaires.
Laver à nouveau la colonne avec 100 volumes de colonne ou quatre millilitres de tampon de lavage pour éliminer tout tétramère H3/H4 non lié, puis éluer les échantillons avec un tampon d’élution. Soumettre les échantillons élués à 18% SDS-PAGE. Ensuite, colorez avec Coomassie bleu brillant R250 et visualisez le gel.
Purifier le dimère H2A/H2B, le tétramère H3/H4 dans le chaperon d’histones individuellement avec le tampon de dialyse en utilisant la chromatographie d’exclusion de taille analytique. Conserver le tampon de l’essai pour préparer d’autres dilutions ultérieurement et l’utiliser comme référence dans la cellule ASC. Pour les échantillons de SSC, mélanger les chaperons purifiés avec du dimère ou du tétramère dans des tubes séparés jusqu’à un volume final de 450 microlitres en utilisant le tampon de dialyse enregistré pour atteindre un OD280 de 0,3 à 0,6.
Assemblez la cellule avec une pièce maîtresse à double secteur et des fenêtres en quartz équipées d’une ultracentrifugeuse analytique avec détecteur d’absorbance. Remplissez 400 microlitres de la solution échantillon et 420 microlitres de tampon de dialyse dans les secteurs de référence et d’échantillon de la cellule, respectivement. Pesez et équilibrez avec précision les cellules et chargez-les dans un rotor en titane à quatre trous.
Alignez les cellules à l’aide des marques situées au bas des cellules et du rotor. Chargez le rotor dans la centrifugeuse, fermez le couvercle et démarrez la course, ce qui permet au vide de se développer et à la température de se stabiliser. Pour l’analyse des données, calculer la densité et la viscosité des composants tampons des protéines et le volume spécifique partiel en fonction de la composition en acides aminés de la protéine à l’aide du programme SEDNTERP.
Chargez les données de la machine AUC dans le programme SEDFIT. Définissez les lignes vertes du ménisque, de la ligne rouge, du bas de la cellule, de la ligne bleue et des limites de l’analyse des données. Choisissez Distribution CS continue comme modèle.
Dans la section des paramètres, définissez la résolution maximale jusqu’à 100. Ensuite, fixez le coefficient de sédimentation minimum à zéro et maximum à 10 à 15. Définissez initialement le rapport de frottement sur 1,2 et choisissez de flotter pour dériver le rapport à partir des données.
Réglez le rapport F à 0,68 pour une régularisation sigma. Définir le volume spécifique partiel, la densité tampon et la viscosité obtenus à partir de la SEDNTURP. Appuyez sur Exécuter pour permettre au logiciel de résoudre l’équation lam.
Appuyez sur Ajuster pour affiner. Choisissez Afficher le pic Mw dans CS dans la fonction d’affichage de la barre d’outils principale pour estimer les masses moléculaires. Mélanger deux tétramères H3/H4 micromolaires et quatre dimères H2A/H2B micromolaires avec des concentrations croissantes de chaperon d’histones, allant de un à six micromolaires, dans un tampon d’assemblage à un volume final de 50 microlitres.
Incuber le mélange à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Simultanément, prétraiter 500 nanogrammes du plasmide PUC-19 super-enroulé négativement avec un microgramme d’enzyme topoisomérase I dans le tampon d’assemblage dans un volume final à 50 microlitres. Ensuite, combinez la solution prémélangée contenant le tétramère, le dimère et le chaperon d’histones avec l’ADN plasmatique détendu.
Ajouter 100 microlitres de tampon stop 2X et incuber pour mettre fin à la réaction d’assemblage en déprotéinisant l’ADN plasmidique. Ajouter un volume égal de phénol saturé en tris dans le tube contenant le mélange réactionnel et bien mélanger le contenu du mélange réactionnel. Ensuite, centrifuger l’échantillon.
Prélever délicatement la phase aqueuse supérieure contenant l’ADN plasmidique à l’aide d’une micropipette et mélanger un volume égal de chloroforme. Vortex le mélange. Ensuite, recueillir la phase aqueuse supérieure, ajouter un volume 1/10 d’acétate de sodium à trois molaires de pH 5,5 et 2,5 volumes d’éthanol glacé.
Bien mélanger la solution en retournant le tube trois à quatre fois. Centrifuger l’échantillon à 16, 200 G pendant 10 minutes et jeter délicatement le surnageant. Gardez les tubes ouverts à température ambiante jusqu’à ce que même des traces d’éthanol s’évaporent, laissant l’ADN plasmidique précipité dans le tube.
Les résultats analytiques de la SEC ont révélé que le domaine nucléoplasmine N-terminal recombinant de la protéine Arabidopsis thaliana FKBP53 est un pentamer de 65 kilodaltons en solution. L’échantillon de nucléoplasmine soumis à un traitement thermique a montré que le domaine est très thermostable. Le domaine nucléoplasmine présentait une stabilité en sel jusqu’à deux molaires de chlorure de sodium et une stabilité à l’urée jusqu’à quatre molaires.
Un essai de pull-down a révélé que l’interaction du domaine nucléoplasmine avec le dimère H2A/H2B était stable jusqu’à 0,4 molaire de chlorure de sodium, alors que l’association avec H3/H4 était stable jusqu’à 0,7 molaire. Le chaperon lie simultanément le dimère H2A/H2B et le tétramère H3/H4, quel que soit l’ordre dans lequel ils sont ajoutés au chaperon, indiquant des sites d’interaction distincts pour les oligomères. Les masses moléculaires estimées par ASC-SV révèlent une stœchiométrie 1:1 du domaine nucléoplasmine avec les oligomères d’histones.
Dans le test de super-enroulement plasmidique, les chaperons d’histones recombinants AtNRP1 et AtNRP2 ont augmenté la quantité de plasmide super-enroulé, suggérant qu’il pourrait déposer des histones sur l’ADN pour former des nucléosomes, provoquant un super enroulement de l’ADN. Le dosage du super-enroulement plasmidique nécessite un soin particulier et une optimisation possible pour la caractérisation de l’ADN des histones et du chaperon. La télémétrie de caractérisation isomérique peut être utilisée comme suivi d’expériences analytiques d’exclusion de taille pour confirmer la stabilité de liaison.
