Danilo Maddalo est récipiendaire d&#39;une bourse de recherche du groupe Young Investigator (YIG) de l&#39;Institut de Technologie de Karlsruhe.

1. Ensemencement des cellules <ol><li> Avant de commencer, faites chauffer le milieu de culture, le PBS 1X et la trypsine dans un bain d&#39;eau à 37 ˚ C </li><li> Prenez les cellules de l&#39;incubateur et aspirer le milieu. </li><li> Appliquez doucement 5 ml de PBS 1X sur les cellules pour les laver. </li><li> Aspirer le PBS 1X et appliquer 1 ml de trypsine EDTA contenant 0,025%. </li><li> Tournez doucement la plaque pour avoir une distribution uniforme de la trypsine. </li><li> Placez les cellules dans l&#39;incubateur à 37 ˚ C pendant 5-10 minutes (selon le type de cellule). Du temps de vérifier le temps si les cellules sont détachées en secouant la plaque. </li><li> Resuspendre les cellules dans 10-20 ml de milieu et de les recueillir dans un tube Falcon de 50 ml. </li><li> Compter les cellules en utilisant un compteur Beckman. Le nombre de cellules devrait être suffisant pour assurer une confluence d&#39;environ 60-70%. </li><li> Assiette des cellules et leur permettent de graines pendant 6-8 heures. </li></ol> 2. Transperfection <ol><li> Avant la transfection, réchauffer une aliquote de milieu sans sérum dans un bain d&#39;eau à 37 ˚ C. </li><li> Porter le gène X-treme de 9 à température ambiante. </li><li> Déposer le milieu sans sérum dans des tubes Eppendorf 2 (1 = 1 tube de transfection). </li><li> Déposer le gène X-treme 9 dans l&#39;attention du milieu sans sérum payer que la pointe ne touche pas le mur en plastique de l&#39;eppendorf et incuber pendant 5 minutes. En attendant de préparer deux mélanges d&#39;ADN: dans un tube mélanger les plasmides pour Renilla, luciole et une lutte antivectorielle vide, dans un autre tube de Renilla, luciole et le chaperon moléculaire. </li><li> Ajouter le mélange d&#39;ADN à chaque Eppendorf contenant milieu sans sérum + X-treme Gene 9, vortex et incuber à température ambiante pendant 20 minutes. </li><li> Ajouter goutte à goutte de chaque mélange sur chaque assiette et laisser incuber pendant 24 heures à 37 ° C et CO 2 5% </li></ol> 3. Fractionnement des cellules <ol><li> 24 heures après transfection, trypsinize les cellules comme décrit dans 1.4 à 1.6 et les diluer à une confluence finale de 60-70% dans une plaque à 6 puits. </li><li> Préparer une plaque pour le contrôle non choqué et que de nombreuses plaques que les points de temps de récupération qui doivent être analysés, comme l&#39;a montré dans la Fig. 2. </li></ol> 4. Choc thermique <ol><li> Pour un choc thermique, préchauffer le sérum contenant du milieu dans un bain d&#39;eau à 37 ˚ C. </li><li> Préparer «tampon de choc thermique» par dilution dans la cycloheximide milieu contenant du sérum à une concentration finale de 20 ug / ml et à 20 mM MOPS. </li><li> Maintenant sortez les plaques de l&#39;incubateur et aspirer le milieu. </li><li> Ajouter à chaque puits 1 ml de «tampon de choc thermique», et incuber pendant 30 minutes à 37 ˚ C et 5% de CO 2 (inclure également la plaque de référence dans ce traitement). Cela arrêtera la synthèse de novo de protéines. </li><li> En attendant le passage sur un bain d&#39;eau et mettre le température à 45 ˚ C. </li><li> Après incubation, sceller le couvercle des plaques avec du Parafilm préalablement coupés en bandes. La plaque de référence (100% de refolfed Firefly) est laissé dans l&#39;incubateur. </li><li> Incuber les plaques à 45 ˚ C pendant 30 minutes. </li><li> Retirez les plaques du bain d&#39;eau, retirez le parafilm et mettre les plaques de revenir à l&#39;incubateur pour permettre la récupération. </li><li> A chaque récolte point dans le temps les cellules et les laver dans du PBS 1X par centrifugation à 2000Xg pendant 1 minute à 4 ˚ C. </li></ol> 5. La lyse cellulaire et le dosage de luciférase <ol><li> Pour une lyse cellulaire efficace, snap figer le culot cellulaire dans l&#39;azote liquide. </li><li> Ajouter 200 ul de tampon de lyse passive dilué à 1:5 dans l&#39;eau bidistillée dans un tube de verre. </li><li> Ajouter 30 ul du lysat cellulaire dans une plaque 96 puits. Chaque échantillon est pipeté en trois exemplaires. </li><li> Seul le «non choqués» des échantillons de référence seront utilisées pourlire l&#39;activité Renilla luciférase, puisque cette étape est utilisé pour vérifier l&#39;efficacité de transfection égaux. </li><li> Préparer les solutions pour le dosage. Pour la solution de luciférine diluer luciférine à une concentration finale de 0,2 mM dans Gly-Gly tampon. Pour diluer le tampon de réaction de la TNT et l&#39;ATP à 1mm concentration finale dans Gly-Gly tampon. Pour un tampon de réaction coelentérazine, diluer coelentérazine à une concentration finale de 0,2 uM dans un tampon de coelentérazine. Conserver la solution luciférine et la lumière du tampon de réaction coelentérazine protégés. </li><li> Maintenant, placez la plaque de 96 puits dans le luminomètre et démarrer le programme «Wallac 1420 Workstation. </li><li> Introduire le PUMP1 dans le tube contenant la solution Falcon coelentérazine. Fermer le couvercle afin qu&#39;aucune lumière ne puisse entrer en contact avec le tube. </li><li> Choisissez dans le menu &#39;entretien Distributeur »de l&#39;option et cochez PUMP1. </li><li> Sélectionnez l&#39;option &#39;Fill&#39;. </li><li> Pour modifier la disposition de la plaque choisissez l&#39;option «Explorer le protocole et les résultats» dans le menu. Sélectionnez le protocole et cliquez deux fois dessus. Maintenant, sélectionnez le puits d&#39;être lu. </li><li> Retour à «Wallac Manager &#39;et cliquez sur&quot; Démarrer &quot;. La réaction entre la luciférase Renilla et son substrat coelentérazine émet de la lumière avec une longueur d&#39;onde maximale de 482 nm. </li><li> Après la lecture, allez sur «l&#39;entretien distributeur» et sélectionnez «vide» et à libérer tous les PUMP1 la solution résiduelle vers le tube. </li><li> Maintenant, déplacez le tube à un tube Falcon contenant de l&#39;eau et de cocher la case &quot;Flush&quot;. </li><li> Après l&#39;étape de rinçage, vider le tube en sélectionnant &#39;vide&#39;. </li><li> Placer le tube d&#39;PUMP1 dans le tube de réaction de tampon faucon et celle de Pump2 dans le tube de luciférine faucon. </li><li> Modifier la mise en assiette. </li><li> Sélectionnez «Remplir» pour PUMP1 et Pump2 du Di &#39;Spenser entretien »du menu. </li><li> Sélectionnez le protocole et commencer la lecture. La réaction entre la luciférase Firefly et son substrat luciférine émet de la lumière avec une longueur d&#39;onde maximale de 560 nm. </li><li> A la fin de la lecture répéter la procédure vide-Flush-vide pour PUMP1 et Pump2. </li><li> Les résultats sont maintenant disponibles dans le «Wallac 1420 Explorer». </li><li> Chaque expérience est associée à un numéro d&#39;essai, identifiant, mot de commencer et la date de fin. </li><li> Les résultats peuvent maintenant être exportés dans un fichier Excel. </li><li> Pour les calculs, les cellules sont divisées en trois groupes: 1. échantillons de référence non choqué (fixée à 100% de la luciférase de luciole repliée), 2. cellules sans chaperon moléculaire et à un choc thermique; 3. cellules avec chaperon moléculaire et choc thermique. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Repliement des protéines est directement liée au temps de récupération donc de tester si le système fonctionne Pro<html> Perly, un test doit être effectuée la collecte des cellules à différents temps. Une corrélation directe du temps / pourcentage de repliement indique que l&#39;expérience a été correctement effectuée et représente donc un facteur limitant. Cependant, il faut toujours considéré que le repliement après le choc thermique est un événement saturer et donc une analyse en temps bon parcours doit être effectué avant de commencer toute expérimentation. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Vue d&#39;ensemble de l&#39;expérience. En test in vivo requiert repliement 3 à 4 jours pour être complétée. Le jour 1, les cellules sont ensemencées et transfectées. Les cellules sont lendemain découpée en un format plus petit et le jour 3, ils sont choqués de la chaleur. À ce point est possible d&#39;effectuer le dosage de luciférase juste après la récolte des cellules ou de sauver le culot cellulaire à -80 ° C et effectuer les essais en un autre moment _content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Fractionnement cellulaire. Le jour 2 cellules sont réparties dans une plaque à 6 puits. Chaque transfection sera dilué dans un puits afin d&#39;avoir tous la transfection sur la même plaque. Chaque plaque correspond à un temps de récupération, plus particulièrement une plaque de référence non choqué. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Représentant bon résultat. A. Pourcentage de repliement directement mesurée par la luciole activité luciférase. Chaque graphique représente le pourcentage de repliement en l&#39;absence (barres noires) et en présence (barres rouges) d&#39;un chaperon moléculaire à différents moments de récupération. B. Corrélation entre le temps et en l&#39;absence de repliement (ligne noire) et en présence (ligne rouge) du chaperon. Les valeurs r au carré montrent une bonne corrélation. Dans Fig.3A est montré un résultat représentatif où les cellules ont été collectées de 15 minutes, 30, 45, 60 et 120 après un choc thermique en l&#39;absence (barres noires) et en présence (barres rouges) de chaperon moléculaire. Pourcentage des replié augmente la luciférase avec le temps de récupération prolongée et à la transfection du chaperon moléculaire. La corrélation entre le repliement et l&#39;heure pour le contrôle (figure 3B, la ligne noire) et le chaperon moléculaire de cellules transfectées (figure 3B, la ligne rouge) est montré. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Représentant mauvais résultat. A. Pourcentage de repliement directement mesurée par l&#39;activité luciférase. Chaque graphique représente le pourcentage de repliement en l&#39;absence (barres noires) et en présence (barres rouges) d&#39;un chaperon moléculaire à différents moments de récupération. B. Corrélation entre le temps et en l&#39;absence de repliement et en présence (rouge L) ine du chaperon. Les valeurs de corrélation r au carré indiquent mauvais. La figure 4A. Montre un résultat représentatif d&#39;une expérience pas correctement effectué. Tant le contrôle (barres noires) et le chaperon moléculaire de cellules transfectées (barres rouges) ne montrent pas une augmentation des protéines de repliement avec le temps. En outre, la transfection du chaperon moléculaire n&#39;a pas abouti à une augmentation de repliement. Cette faible corrélation est confirmée dans la Fig. 4B montrant une valeur r au carré de 0,6619 et de 0,1882 respectivement pour le contrôle (ligne noire) et le chaperon moléculaire de cellules transfectées (ligne rouge).

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	<li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+and+protein+quality+control.">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li><li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+heat+shock+response.">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li><li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins.">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li><li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+proteins+and+drug+resistance.">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li><li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology.">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li><li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer.">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG:+mechanisms+of+antitumour+activity.">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li><li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HSP70+for+cancer+therapy.">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li><li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats.">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li><li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK,+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage.">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li><li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate.">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li><li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease.">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li><li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity.">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Dans ce travail, un protocole visant à mesurer l&#39;activité de repliement intracellulaire de chaperons moléculaires sont présentés. Le dosage de l&#39;ensemble peut être réalisé en 3 à 4 jours comme indiqué par la vue d&#39;ensemble sur la Fig. 1. La robustesse et la linéarité du signal de la lumière produite par la luciole et la luciférase Renilla représentent une base solide pour la reproductibilité du protocole. L&#39;étape ...

Pour cette expérience «Lumière Vector &#39;une forme Luminomètre Perkin Elmer &#39;1420 compteur de luminescence a été utilisé Programmes pour le luminomètre: Renilla: Pompe 1, injection de 100 ul Reaction Buffer: PUMP1, 70 d&#39;injection ul Luciférine: Pump2, injection 30μl Pour les tampons préparer ces solutions de stock dans de l&#39;eau bidistillée: <ul style="list-style:none"><li> - 1M MgSO 4: 246,48 g MgSO 4 * 7H 2 O dans 1 litre </li><li> - 0,5 M EGTA: 190,18 g dans 1 litre d&#39;EGTA </li><li> - 1M KH 2 PO 4: 136,09 g de KH 2 PO 4 dans 1 litre </li><li> - 1M K2 HPO 4: 228,23 g K 2 HPO 4 * 3 H 2 O dans 1 litre </li><li> - NaCl 5M: 292,2 g de NaCl dans 1 litre </li><li> - 0,5 M d&#39;EDTA: 186,12 g EDTA * 2H 2 O dans 1 litre &nbsp;</li></ul> GLY-GLY-tampon: <ul style="list-style:none"><li> - 25mm Glycylglycin </li><li> - 15mm MgSO 4 </li><li> - 4mm EGTA </li></ul> Pour une utilisation litre 3,3 g de Glycylglycin, 15ml d&#39;une solution 1M MgSO4 et 8ml d&#39;une solution 0,5 M EGTA. Résoudre dans l&#39;eau, ajuster le pH à 7,8 et porter à un volume total de 1 litre. Tampon de réaction pour Renilla / coelentérazine mémoire tampon: <ul style="list-style:none"><li> - &amp; Nbsp; 13,4 mM KH 2 PO 4 </li><li> - 86,6 mM KH 2 PO 4 </li><li> - 0,5 M de NaCl </li><li> - 1mm d&#39;EDTA </li></ul> Pour une utilisation litres 13,4 ml d&#39;une 1M KH 2 PO 4, 86,6 ml d&#39;une 1M K 2 HPO 4 solution, 100 ml d&#39;une solution de NaCl 5M et 2ml d&#39;une solution 0,5 M d&#39;EDTA. <table border="1"><tr><td></td><td> Société </td><td> Catalogue / Numéro de produit: </td></tr><tr><td> DMEM (Dulbecco Modified Eagle Médium 1X) </td><td> GIBCO </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> Or le fœtus de sérum bovin </td><td> AAP </td><td> A15-151 </td></tr><tr><td> X-treme Gene 9 Réactif de transfection d&#39;ADN </td><td> Roche </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> PBS Phosphate de Dulbecco saline tamponnée 1X </td><td> GIBCO </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> MOPS 3 - (N-morpholino) propane sulfonique </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> Lysis Buffer 5X passif </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (MgSO 4 * 7H 2 O) </td><td> SIGMA-ALDRICH Roth Roth </td><td> G7278 3054.2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3 H 2 O) NaCl EDTA </td><td> Roth Roth Roth Roth </td><td> 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 </td></tr><tr><td> Luciférine Firefly </td><td> Biosynth </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Coelentérazine </td><td> Biosynth </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (dithiothréitol) </td><td> Roth </td><td> 6908.2 </td></tr><tr><td> ATP (adénosine triphosphate) </td><td> Roche </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

intracellular refolding assay

Ce protocole décrit une méthode pour mesurer l&#39;activité enzymatique de chaperons moléculaires dans un système basé sur des cellules et les effets possibles des composés ayant une activité inhibitrice / stimulant. Chaperons moléculaires sont des protéines impliquées dans la régulation de repliement des protéines 1 et ont un rôle crucial dans la promotion de la survie des cellules après les insultes de stress comme deux de choc thermique, la famine en éléments nutritifs et l&#39;exposition aux produits chimiques / poisons 3. Pour cette raison, les accompagnateurs sont trouvés d&#39;être impliqués dans des événements comme le développement des tumeurs, chemioresistance de 4 cellules cancéreuses ainsi que la neurodégénérescence 5. Conception de petites molécules capables d&#39;inhiber ou de stimuler l&#39;activité de ces enzymes est donc l&#39;une des stratégies les plus étudiés pour 7 thérapie du cancer et les maladies neurodégénératives 9. Le test décrit ici offre la possibilité de mesurer l&#39;activité de repliement d&#39;un chaperon moléculaire particulière et d&#39;étudier l&#39;effet de la maquetteounds sur son activité. Dans cette méthode, le gène de l&#39;enquête chaperon moléculaire est transfecté avec une vecteur d&#39;expression codant pour le gène de la luciférase de luciole. Il a déjà été décrit que dénaturée luciférase de luciole peut être replié par des chaperons moléculaires 10,11. Comme normaliser le contrôle de transfection, un vecteur codant pour le gène de la luciférase Renilla est transfecté. Toutes les transfections décrites dans ce protocole sont effectués avec X-treme Gene 11 (Roche) dans les cellules HEK-293. Dans la première étape, la synthèse protéique est inhibée par le traitement des cellules avec du cycloheximide. Par la suite, le dépliement des protéines est induite par choc thermique à 45 ° C pendant 30 minutes. Lors de la récupération à 37 ° C, les protéines sont à nouveau repliés dans leur conformation active et l&#39;activité de la luciférase de luciole est utilisé comme lecture: plus la lumière sera produite, le plus de protéines auront regagné la conformation d&#39;origine. Non-thermique cellules choqués sont fixés comme référence (100% des repliéeluciférase).

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Intracellular Refolding Assay

Dans ce protocole, une méthode pour mesurer le repliement des protéines intracellulaires, après choc thermique est décrite. Cette méthode peut être utilisée pour étudier foldases comme chaperons moléculaires et leurs co-facteurs ou des composés capables d&#39;influencer leur activité. Firefly activité luciférase est utilisée en tant que reporter pour mesurer l&#39;activité de repliement chaperon.

Assay Repliement intracellulaire

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K vues.  Karlsruhe Institute of Technology. Dans ce protocole, une méthode pour mesurer le repliement des protéines intracellulaires, après choc thermique est décrite. Cette méthode peut être utilisée pour étudier foldases comme chaperons moléculaires et leurs co-facteurs ou des composés capables d'influencer leur activité. Firefly activité luciférase est utilisée en tant que reporter pour mesurer l'activité de repliement chaperon.

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Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Mesure Proche membrane plasmique et mondiale dynamique du calcium intracellulaire dans les astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Recherche

Biologie

Aortic Ring Assay

Angiogenesis, the sprouting of blood vessels from preexisting vasculature is associated with both natural and pathological processes. Various angiogenesis assays involve the study of individual endothelial cells in culture conditions (1). The aortic ring assay is an angiogenesis model that is based on organ culture. In this assay, angiogenic vessels grow from a segment of the aorta (modified from (2)). Briefly, mouse thoracic aorta is excised, the fat layer and adventitia are removed, and rings approximately 1 mm in length are prepared. Individual rings are then embedded in a small solid dome of basement matrix extract (BME), cast inside individual wells of a 48-well plate. Angiogenic factors and inhibitors of angiogenesis can be directly added to the rings, and a mixed co-culture of aortic rings and other cell types can be employed for the study of paracrine angiogenic effects. Sprouting is observed by inspection under a stereomicroscope over a period of 6-12 days. Due to the large variation caused by the irregularities in the aortic segments, experimentation in 6-plicates is strongly advised. Neovessel outgrowth is monitored throughout the experiment and imaged using phase microscopy, and supernatants are collected for measurement of relevant angiogenic and anti-angiogenic factors, cell death markers and nitrite.

Angiogenesis, the sprouting of blood vessels from pre-existing vasculature, is associated with both natural and pathological processes. Here we demonstrate an aortic ring assay that allows angiogenic potentiators and inhibitors to be directly added to aortic rings in culture. Sprouting and neovessel outgrowth can be determined by inspecting the aortic rings over a period of 6-12 days.

Assay anneau aortique

Angiogenesis, the sprouting of blood vessels from preexisting vasculature is associated with both natural and pathological processes. Various angiogenesis ...

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase. Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed. However, RhoC GTPase is expressed in metastatic cancer cells at relatively low levels. Therefore, few RhoC-specific reagents have been developed. We have adapted a Rho activation assay to detect RhoC GTPase. This technique utilizes a GST-Rho binding domain fusion protein to pull out active RhoC GTPase. In addition, we can harvest total protein at the beginning of the assay to determine levels of total (GTP and GDP bound) RhoC GTPase. This allows for the determination of active versus total RhoC GTPase in the cell. Several commercial versions of this procedure have been developed however, the commercial kits are optimized for RhoA GTPase and typically do not work well for RhoC GTPase. Parts of the assay have been modified as well as development of a RhoC-specific antibody.

This protocol utilizes a pull down assay to determine the levels of active RhoC GTPase within cells.

Assay RhoC activation GTPase

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Les analyses couplées pour la surveillance protéines repliement<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopie intravitale pour l&#39;imagerie Subcellular ouvrages chez des souris vivantes exprimant des protéines fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

Imagerie du trafic intracellulaire de l&#39;APP avec la GFP photoactivable

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein belonging to the prion family. A chromatographic method for the purification of (His)6-tagged recombinant Shadoo expressed as inclusion bodies is described. The inclusion bodies are solubilized in 8 M urea and bound to a Ni2+-charged column to perform ion affinity chromatography. Bound proteins are eluted by a gradient of imidazole. Fractions containing Shadoo protein are subjected to size exclusion chromatography to obtain a highly purified protein. In the final step purified Shadoo is desalted to remove salts, urea and imidazole. Recombinant Shadoo protein is an important reagent for biophysical and biochemical studies of protein conformation disorders occurring in prion diseases. Many reports demonstrated that prion neurodegenerative diseases originate from the deposition of stable, ordered amyloid fibrils. Sample protocols describing how to fibrillate Shadoo into amyloid fibrils at acidic and neutral/basic pHs are presented. The methods on how to produce and fibrillate Shadoo can facilitate research in laboratories working on prion diseases, since it allows for production of large amounts of protein in a rapid and low cost manner.

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

Purification et le repliement de fibrilles d&#39;amyloïde de (Son)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged protéine recombinante Shadoo Exprimé en corps d&#39;inclusion dans<em&gt; E. coli</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

Optique pH Quantification d’intracellulaire dans l’épithélium des tubules Malpighian Drosophila melanogaster ayant un pH fluorescents génétiquement codé indicateur

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

La microscopie vidéo sans lentille pour la dynamique et l’analyse Quantitative de la Culture de cellules adhérentes

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Assay Repliement intracellulaire

Résumé

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Chapitres dans cette vidéo

Mesure Proche membrane plasmique et mondiale dynamique du calcium intracellulaire dans les astrocytes

Assay anneau aortique

Assay RhoC activation GTPase

Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination

Les analyses couplées pour la surveillance protéines repliement

Microscopie intravitale pour l'imagerie Subcellular ouvrages chez des souris vivantes exprimant des protéines fluorescentes

Imagerie du trafic intracellulaire de l'APP avec la GFP photoactivable

Purification et le repliement de fibrilles d'amyloïde de (Son)

Optique pH Quantification d’intracellulaire dans l’épithélium des tubules Malpighian Drosophila melanogaster ayant un pH fluorescents génétiquement codé indicateur

La microscopie vidéo sans lentille pour la dynamique et l’analyse Quantitative de la Culture de cellules adhérentes