L’objectif global de cette procédure est de reproduire la plupart des aspects essentiels de la maladie de Parkinson dans un modèle animal. L’administration stéréotaxique de vecteurs viraux adéno-associés, codant pour la synucléine humaine dans la substantia nigra. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui implique la mort du neurone dopaminergique, dans la voie nigrostriatale, et par conséquent, la progression de la perte de contrôle du mouvement volontaire.
Ce processus neurodégénératif s’accompagne d’un dépôt d’agrégats protéiques dans le cerveau, qui sont principalement constitués de synucléine. De nouvelles preuves ont indiqué que les agrégats de synucléine peuvent stimuler des récepteurs de type toll sur la microglie, déclenchant ainsi une inflammation neurale dans la substantia nigra. En outre, les preuves indiquent que les agrégats de synucléine peuvent être capturés et présentés, par des cellules présentatrices d’antigènes aux cellules T, induisant une réponse immunitaire adaptative spécifique à la synucléine.
L’administration stéréotaxique de vecteurs viraux adéno-associés codant pour la synucléine humaine dans la substantia nigra a montré qu’elle reproduisait de nombreux aspects essentiels de la maladie, notamment la pathologie de la synucléine, l’activation microgliale, l’activation des lymphocytes T, la neurodégénérescence et la déficience motrice. Cette étude présente une analyse de la façon dont un vecteur viral et le temps après l’administration du vecteur viral, affecte l’étendue de l’expression de la synucléine humaine, la neurodégénérescence et la neuroinflammation dans la voie nigrostriatale, ainsi que le degré de déficience motrice dans un modèle murin d’administration stéréotaxique unilatérale de synucléine humaine dans la substantia nigra. Pour maintenir un environnement aseptique, portez des vêtements chirurgicaux appropriés pendant toute la chirurgie, y compris des couvre-chaussures, un masque chirurgical, une barrière sanitaire, des gants et une casquette chirurgicale.
Vaporisez de l’éthanol sur la souris et tout le matériel chirurgical pour maintenir l’environnement aseptique. Pour induire une analgésie, injecter du carprofène par voie sous-cutanée toutes les 12 heures, en commençant une heure avant la chirurgie et en continuant jusqu’à trois jours après la chirurgie. Pour anesthésier la souris, placez l’animal dans une chambre à induction.
Ouvrez le débit d’isoflurane à une vitesse de 0,5%, puis augmentez-le lentement jusqu’à 5% sur environ cinq minutes jusqu’à ce que la souris ait perdu son réflexe de redressement. Retirez l’animal de la chambre d’induction. Transférez immédiatement l’animal dans un circuit non respirant avec un cône de nez de taille appropriée.
Maintenir l’anesthésie de la souris, avec de l’isoflurane 1% pendant toute la durée de la chirurgie. Vérifiez que la souris est entièrement anesthésiée en pinçant sa queue et ses pattes. Lorsque la souris ne réagit pas en pinçant la queue et les pattes, cela signifie que la souris est complètement anesthésiée.
Rasez la tête de la souris à l’aide de ciseaux. Nettoyez la peau de la souris à l’aide d’un coton-tige avec de la chlorhexidine 2% et enlevez tous les poils. Fixez la tête de la souris dans le cadre stéréotaxique.
Placez un protecteur cornéen dans les deux yeux de souris, à l’aide d’un coton-tige. Pour prévenir l’induction du stress chez d’autres rongeurs, évitez la présence de toute autre souris dans la salle de chirurgie. Nettoyez la tête de la souris avec trois tours de chlorhexidine 2% suivis d’éthanol 70%Exposez le crâne à l’aide de matériel chirurgical et faites un trou mince avec une perceuse aux coordonnées antéropostérieures 2,8 mm et médiolatérales 1,4 mm, par rapport à la ligne médiale.
Mettez l’aiguille d’une seringue de 10 microlitres dans le trou et déplacez l’aiguille à l’intérieur du cerveau lentement, jusqu’à ce qu’elle atteigne 7,2 mm dorsoventral, par respect pour la dure-mère. Laissez l’aiguille en position finale pendant deux minutes, pour permettre au tissu de se déposer un peu, puis injectez un microlitre de vecteurs viraux dans la substantia nigra droite, à raison de 0,2 microlitre toutes les 30 secondes. Laissez l’aiguille dans la même position pendant cinq minutes après l’administration des vecteurs viraux, puis retirez-la lentement.
Fermez la plaie à l’aide d’une suture de soie stérile. Mettez la souris dans la cage de la maison, préchauffée en la plaçant sur un matelas chaud électrique. 12 semaines après la chirurgie stéréotaxique, évaluez les performances motrices à l’aide d’une version simplifiée du test de faisceau, décrite précédemment.
À cette fin, utilisez une poutre horizontale de 25 cm de longueur et 3 cm de largeur. La surface de la poutre doit être recouverte d’une grille métallique avec des carrés d’un centimètre et surélevée d’un centimètre au-dessus de la poutre. Faites une vidéo de la souris, tout en traversant le faisceau de surface de la grille, d’une extrémité à l’autre extrémité de la poutre, où se trouve la cage de la maison.
Entraînez la souris pendant deux jours, avant la détermination des performances du moteur. Le premier jour, entraînez la souris à traverser le faisceau cinq fois, sans la grille. Le deuxième jour, entraînez la souris à marcher à travers le faisceau, en présence de grille cinq fois.
Le troisième jour, évaluez les performances du moteur. Pour ce faire, quantifiez le nombre d’erreurs effectuées, par les pattes gauches ou par les pattes droites séparément, en regardant les vidéos en mode ralenti. Pour anesthésier la souris, injecter un mélange de kétamine et de xylazine par voie intrapéritonéale.
Une fois que la souris est complètement anesthésiée, ouvrez le thorax avec du matériel chirurgical et exposez le cœur. Insérez ensuite une aiguille à pointe plate dans le ventricule gauche du cœur. En couplant l’aiguille à un tuyau, perfuser 50 millilitres de solution saline tampon phosphate, à raison de 9,5 millilitres par minute, à l’aide d’une pompe péristaltique.
Retirez le cerveau à l’aide de ciseaux et de pinces à épiler, puis fixez-le par immersion, dans cinq millilitres de paraformaldéhyde à 4%, dans une solution saline tampon phosphate. Ensuite, mettez le cerveau fixe, dans 15 millilitres de saccharose à 30% pendant 48 heures. Ensuite, mettez le cerveau dans quatre millilitres de solution de cryoprotection et sauvez le cerveau à 80 degrés, ou utilisez-le immédiatement à l’étape suivante.
Pour obtenir des tranches striatales, coupez le cerveau en sections de 40 micromètres d’épaisseur, en commençant à 1,34 mm et en terminant à 0,26 mm. Récoltez chaque tranche dans un cryotube de deux millilitres, selon l’ordre antéropostérieur. Pour effectuer une analyse immunohistochimique et immunofluorescente dans le striatum, choisissez cinq sections striatales coronales prises à intervalles uniformes, qui couvrent toute l’étendue rostrocaudale du noyau.
Pour valider l’administration correcte de vecteurs viraux dans les neurones dopaminergiques de la voie nigrostriatale, des vecteurs codant pour la GFP ont été injectés, dans la substantia nigra, et 12 semaines plus tard, la fluorescence GFP et l’immunoréactivité de la tyrosine hydroxylase ont été analysées dans la substantia nigra et le striatum par immunofluorescence. La fluorescence associée à la GFP a été localisée exclusivement dans le site ipsilatéral, et une colocalisation significative avec l’immunoréactivité de la tyrosine hydroxylase a été observée à la fois dans la substantia nigra et le striatum, indiquant l’administration correcte de vecteurs viraux dans les neurones dopaminergiques de la voie nigrostriatale. Pour tester la dose de vecteurs, codant pour la synucléine nécessaire, afin d’induire une surexpression significative de la synucléine humaine qui favorise la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques nigraux, différentes doses des vecteurs ont été injectées.
Et 12 semaines plus tard, l’immunoréactivité de la synucléine humaine et l’étendue de l’immunoréactivité de la tyrosine hydroxylase ont été testées dans la voie nigrostriatale. L’immunoréactivité de la synucléine humaine était évidente, toutes les doses ayant été testées dans la substance noire. Cependant, seules les souris recevant de 10 à 10 génomes viraux par souris présentaient une immunoréactivité évidente de la synucléine humaine dans le striatum.
Les souris recevant 10 à 10 génomes viraux par souris de vecteurs codant pour la synucléine humaine, ont montré une perte significative de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra. Bien que les souris recevant la même dose de vecteurs codant pour la GFP présentaient un faible degré de perte neuronale, ces souris présentaient un degré de neurodégénérescence significativement plus faible, par rapport aux souris recevant des vecteurs, codant pour la synucléine humaine. En utilisant le test au faisceau, une réduction significative des performances motrices a été détectée exclusivement chez ces souris, recevant 10 à 10 génomes viraux par souris de vecteurs codant pour la synucléine humaine, lors de la comparaison du nombre d’erreurs commises par les pattes droite et gauche, ou lors de la comparaison du nombre total d’erreurs, de souris recevant des vecteurs codant pour la synucléine humaine, avec ces souris recevant le vecteur témoin.
Pour définir le début de l’expression de la synucléine humaine, les souris ont été traitées avec 10 à 10 génomes viraux par souris, de vecteurs codant pour la synucléine humaine, ou chirurgie simulée, et l’étendue de l’expression de la synucléine humaine a été analysée dans la substantia nigra, une fois par semaine, pendant les semaines deux à cinq après la chirurgie stéréotaxique. Les résultats montrent que l’expression de la synucléine humaine a commencé à être évidente à la cinquième semaine après la chirurgie stéréotaxique. Pour déterminer le pic d’activation microgliale, l’étendue des cellules exprimant des niveaux élevés d’Iba1 a été quantifiée dans le striatum de souris, pendant les semaines 2 à 15 après la chirurgie.
Les résultats montrent une augmentation significative de l’activation microgliale du côté ipsilatéral, par rapport au côté controlatéral des souris, 15 semaines après l’inoculation virale. Le nombre de lymphocytes T régulateurs infiltrés dans le nigra substantiel a été analysé à différents moments, après la chirurgie stéréotaxique par immunofluorescence, suivie d’une observation par microscopie confocale. Le pic d’infiltration des lymphocytes T régulateurs dans la substantia nigra a été observé à la semaine 11 après la chirurgie.
Le modèle murin de neurodégénérescence analysé ici, représente un modèle utile pour étudier les nombres d’aspects clés impliqués dans la physiopathologie de la maladie de Parkinson. Mécanismes d’implication impliqués dans la pathologie de la synucléine, l’activation microgliale, l’implication du système immunitaire périphérique, dans la neuroinflammation et les mécanismes de la neurodégénérescence Une dose appropriée de vecteur viral adéno-associé, sous-type cinq codant pour la synucléine humaine pour induire la neurodégénérescence, la neuroinflammation, l’infiltration des lymphocytes T et la déficience motrice, est de 10 à 10 génomes viraux par souris. Cette étude montre que cinq semaines après la chirurgie stéréotaxique, constitue un moment clé, dans lequel l’expression de la synucléine humaine était déjà évidente, mais en l’absence de déficience motrice dans ce modèle animal.
Ainsi, ce point temporel représente un point temporel intéressant, pour commencer l’administration de thérapies expérimentales adaptées pour arrêter la progression de la neuroinflammation et de la neurodégénérescence. Le moment le plus approprié pour analyser la neuroinflammation dans ce modèle animal est la semaine 15 après une chirurgie stéréotaxique. Bien qu’il s’agisse d’un bon moment pour analyser l’infiltration des lymphocytes T dans le système nerveux central.
semble être à la semaine 11 après l’inoculation du vecteur viral.
