L’estimation du nombre de neurones dopaminergiques dans le nigra de substantia est une mesure de résultats clé dans la recherche sur la maladie de Parkinson. Ce protocole raccourcit considérablement la charge de travail requise pour estimer le nombre de neurones. Cette méthode fournit un processus efficace dans le temps et précis pour détecter les changements dans le nombre de neurones dopaminergiques et convient pour déterminer l’effet des interventions sur la survie cellulaire.
Cette méthode pourrait être facilement adaptée pour fournir des comptages précis de neurones dans différentes régions du cerveau tout en maintenant les avantages de coût et de temps par rapport aux méthodes thétéologiques traditionnelles. Pour capturer des images IHC, utilisez le logiciel couplé à un microscope confocal à un grossissement 10X. Ouvrez le trou de la goupille à 1,5 unité de surface pour capturer un plan large totalisant 1,5 micromètre et mettre l’accent sur le côté injecté du cerveau.
Dans l’onglet Acquisition, cochez l’option d’imagerie par balayage de tuiles et définissez les dimensions sur 10 par quatre. Sous le panneau du mode d’acquisition, définissez le zoom sur 1.1 pour éviter toute marque d’assemblage entre les images de numérisation de tuiles. Définissez la taille d’image sur 1024 par 1024 pixels et la moyenne sur deux pour garantir l’acquisition d’images de haute qualité.
Dans le panneau des canaux, définissez la piste un sur Alexa 488 et la piste deux sur Alexa 555. Chargez la glissière sur la scène et choisissez une section avec une forte coloration TH. Cliquez en direct sur le panneau d’acquisition.
Dans le panneau des canaux, réglez la force et le gain du laser à des niveaux qui maximisent le signal et limitent le bruit de fond. Utilisez l’indicateur de portée pour vous assurer que les signaux ne sont pas surexposés. Répétez cette opération avec plusieurs diapositives.
Sous l’onglet acquisition, cochez la case positions. Pour commencer l’imagerie, utilisez l’oculaire et choisissez la première section montrant une coloration TH positive. Ensuite, définissez le focus sur le point d’intérêt et déplacez la scène vers la ligne médiane de la section.
Cela enregistre la position dans les axes X, Y et Z et image une analyse de tuiles capturant toute la section. Répétez cette opération pour toutes les autres diapositives, y compris un site non injecté. Séparez les fichiers image à l’aide du logiciel approprié et importez-les dans un logiciel d’analyse d’image automatisé.
Définissez une région d’intérêt en sélectionnant l’outil d’annotation plume pour dessiner une annotation autour de substantia nigra pars compacta. Passez à l’onglet Analyse et sélectionnez réglage en temps réel dans le menu déroulant Analyser. Cela ouvre une fenêtre séparée sur l’image de la section permettant de modifier en temps réel les paramètres d’analyse.
Sous la section grossissement de l’analyse, sélectionnez le zoom d’image approprié. Dans la section détection cellulaire, sélectionnez le colorant nucléaire comme colorant utilisé pour la coloration TH. Ajustez le seuil de contraste nucléaire, l’intensité nucléaire minimale, l’agressivité de la segmentation nucléaire et les paramètres de taille nucléaire tout en surveillant attentivement la fenêtre de réglage du temps.
Répétez ce processus avec plusieurs échantillons. Une fois qu’un nombre approprié d’images a été échantillonné et que le réglage en temps réel a été ajusté en conséquence, enregistrez les paramètres d’analyse dans le menu déroulant Actions des paramètres. Sélectionnez toutes les images à analyser et cliquez sur analyser.
Choisissez le paramètre d’analyse qui vient d’être enregistré et, dans la fenêtre de la région d’analyse, cochez la case Couches d’annotations, puis cochez la première couche et cliquez sur Analyser. Une fois terminé, exportez les données d’analyse récapitulatives pour toutes les sections en sélectionnant l’option d’exportation des données d’analyse d’objet. Cet ensemble de données pourrait être utilisé pour examiner les changements dans la taille des cellules en réponse à une toxine ou à un traitement.
Pendant six semaines après des injections associées de virus ou d’AAV d’adeno, l’injection stereotactic d’AAV exprimant l’alpha synuclein du mutant A53T dans le nigra de substantia dans le cerveau de rat a eu comme conséquence une réduction significative de la densité des neurones dopaminergiques. Le nombre moyen de neurones positifs de TH par millimètre au carré dans le nigra de substantia des rats injectés avec AAV-A35T a été sensiblement diminué par rapport à celui des rats injectés avec le vecteur vide d’AAV. Des observations semblables ont été faites utilisant la stéréologie impartiale.
Lorsque vous tentez ce protocole, gardez à l’esprit que le logiciel n’est aussi utile que s’il est formé pour l’être. Par conséquent, il faut prendre le temps et le soin de s’assurer qu’une seule cellule est identifiée comme une seule cellule. Le logiciel peut être adapté pour mesurer une intensité de fluorescence d’autres protéines d’intérêt telles que l’alpha-synucléine afin de déterminer si les traitements peuvent moduler les niveaux de protéines.
Cette technique a permis une plus grande efficacité lors de l’essai de l’effet de plusieurs thérapies potentielles sur la densité des neurones dopaminergiques.
