La cybergénération est toujours le protocole de pointe pour comprendre le rôle pathogène de toute nouvelle mutation de l’ADN mitochondrial et pour corréler le pourcentage d’atriplasmie avec la gravité de la maladie. Cette technique permet d’effectuer une investigation biochimique dans un système nucléaire homogène, dans lequel la contribution du fond nucléaire du patient est absente. Cette technique permet de valider la pathogénicité d’une mutation de l’ADN mitochondrial.
et permet d’étudier son impact au niveau biochimique Laver les plats de 35 millimètres contenant les fibroblastes deux fois en utilisant deux millilitres de 1X PBS sans calcium ni magnésium. Nettoyez la surface extérieure de la vaisselle avec 70% d’éthanol et attendez que l’alcool s’évapore. Retirez les couvercles de la vaisselle et les bouchons à vis des bouteilles.
Placez chaque plat sans le couvercle à l’envers au fond de chaque bouteille de centrifugeuse de 250 millilitres. Ajouter lentement 32 millilitres d’un milieu de nucléation à chaque bouteille permettant au milieu d’entrer dans le plat et d’entrer en contact avec les cellules. Retirez toutes les bulles de la vaisselle à l’aide d’une longue pipette de pâturage en verre, en courbant la pointe dans une flamme de bunsen.
Fermez chaque bouteille avec le bouchon à vis et transférez-les à la centrifugeuse. Centrifuger pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius et 8 000 x G.Aspirer le milieu des bouteilles et le jeter. Retirez la vaisselle en inversant les bouteilles sur une gaze stérile préalablement pulvérisée avec de l’éthanol à 70%.
Nettoyez la surface extérieure de la vaisselle et de leurs couvercles avec de l’éthanol à 70% et fermez la vaisselle après l’évaporation de l’éthanol. Avant de procéder, vérifiez la formation de cytoplastes à l’aide d’un microscope inversé pour les cellules vivantes. Recherchez des fibroblastes extrêmement allongés en raison de l’extrusion de leurs noyaux induite par la cytochalasine.
À chaque plat de 35 millimètres, ajoutez 1 000, 143 cellules de rangée zéro. Remis en suspension dans deux millilitres de milieu de culture complété par 5% FBS. Laissez la vaisselle pendant trois heures dans un incubateur à dioxyde de carbone humidifié pour déposer les 143 cellules de la rangée zéro sur les fantômes.
Après trois heures d’incubation, aspirer et jeter le milieu. Lavez les cellules d’adhérence deux fois avec deux millilitres de milieu de glucose élevé DMEM sans sérum ni MEM, puis aspirez et jetez le milieu. Ajouter 500 microlitres de solution de polyéthylène glycol aux cellules et incuber pendant exactement une minute.
Aspirer et jeter la solution de polyéthylène glycol. Lavez les cellules trois fois avec deux millilitres de DMEM à haute glycémie sans sérum ou avec MEM. Ajouter deux millilitres de milieu de fusion et incuber pendant la nuit dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Trypsiniser les cellules dans les boîtes de culture restantes Les compter et les ensemencer dans une ou plusieurs boîtes de Pétri Ajouter 50 à 100 cellules par plat dans la culture supplémentée jusqu’à l’apparition de clones. Ensuite, laissez-les pousser pendant plusieurs jours. À l’aide d’un stéréomicroscope, ramassez les clones de la boîte de Pétri avec des cylindres de clonage ou une pointe de pipette.
Essayez d’éviter de mettre en commun différents clones et transférez-les sur une plaque de 96 puits, chaque puits contenant 200 microlitres de milieu de culture supplémenté. Les cybrides ont été générées à partir de fibroblastes dérivés d’un patient porteur de l’hétéroplasmique M2343A2G L’une des mutations les plus courantes de l’ADN mitochondrial associées à la myopathie mitochondriale, à l’acidose lactique encéphalopathie et aux épisodes de type accident vasculaire cérébral. L’analyse d’un nombre variable de répétitions en tandem a montré que le cyber-ADN est identique aux cellules de la rangée zéro confirmant le remplacement du cyber-ADN du patient par le génome 143 B.
Le polymorphisme de longueur de fragment de restriction, ou analyses de séquençage, peut être utilisé pour évaluer la présence de la mutation de l’ADN mitochondrial et le pourcentage d’hétéroplasmie. Lors de la tentative de ce protocole, il est important de vérifier l’actif génétique correct du nucléon et de l’ADN mitochondrial, ainsi que la quantité d’ADN mitochondrial dans les cybrides repeuplés.
