Nous introduisons une méthode pour établir la culture organoïde de l’épithélium des voies respiratoires humaines dans des plaques de culture. Nous dérivons des organoïdes pulmonaires humains directement à partir de tissus pulmonaires primaires avec une grande efficacité. Les organoïdes pulmonaires humains dérivés sont développés de manière stable pendant plus d’un an, et un protocole de différenciation proximale permet la génération d’organoïdes des voies respiratoires matures qui peuvent simuler fidèlement l’épithélium des voies respiratoires humaines à un niveau proche de celui physiologique.
Par conséquent, le système de culture permet aux scientifiques de reconstruire et d’étendre l’épithélium des voies respiratoires humaines dans des plaques de culture. Man Chun Chiu et Yifei Yu, doctorants dans notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure Pour commencer l’isolement cellulaire des tissus pulmonaires humains pour la culture organoïde 3D, hacher les tissus pulmonaires en petits morceaux d’un millimètre avec un scalpel stérile et laver les morceaux de tissu avec 10 millilitres de milieu basal froid. Centrifuger les tissus à 400 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant avant de remettre la pastille dans huit millilitres de milieu basal complété par de la collagénase à une concentration finale de deux milligrammes par millilitre.
Ensuite, digérez les morceaux de tissu en secouant le tube à 120 tr / min pendant 30 à 40 minutes à 37 degrés Celsius. Après la digestion, pipettez de haut en bas 20 fois à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres pour cisailler les morceaux de tissu digérés. Ensuite, filtrez la suspension avec une passoire de 100 microns dans un tube de 50 millilitres.
Récupérez et transférez les morceaux de tissu de la passoire dans un tube centrifuge de 15 millilitres avec le milieu basal. Pour terminer la digestion, ajouter le sérum bovin fœtal au flux jusqu’à une concentration finale de 2%Ensuite, centrifuger le tube et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 millilitres du milieu basal comme décrit précédemment. Après centrifugation, remettre en suspension la pastille dans 80 à 160 microlitres de milieu de matrice de sous-sol froid et placer les tubes sur de la glace.
Ensuite, distribuez 40 microlitres de la suspension à chaque puits d’une plaque de culture de suspension préchauffée à 24 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Laissez la matrice du sous-sol se solidifier et former une gouttelette.
Après l’incubation, ajouter 500 microlitres de milieu d’expansion des organoïdes pulmonaires humains complétés par cinq nanomolaires d’héréguline-bêta 1 à chaque puits et incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire. Après trois jours, retirez l’ancien milieu tout en gardant la gouttelette intacte et ajoutez soigneusement le milieu frais. Après 10 à 14 jours de passage, observez les organoïdes au microscope et assurez-vous que les organoïdes ne sont pas incrustés avec une densité cellulaire très élevée.
Pour passer les organoïdes pulmonaires avec cisaillement, cassez les gouttelettes en pipetant de haut en bas avec une pointe d’un millilitre. Ensuite, transférez les organoïdes avec le milieu dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et ajustez le volume à 10 millilitres avec un milieu basal froid. Centrifugez le tube à 300 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, jetez le surnageant et lavez les organoïdes avec 10 millilitres de milieu basal froid.
Ensuite, remettez en suspension les organoïdes dans deux millilitres de milieu basal froid et cisaillez en petits morceaux avec une pipette Pasteur. Ensuite, ajoutez le milieu basal à un volume total de 10 millilitres et centrifugez avant de remettre en suspension les fragments organoïdes avec une matrice de sous-sol froide suffisante pour permettre une expansion de 1:3 à 1:5 et placez les tubes sur de la glace. Distribuer 40 microlitres de suspension organoïde dans chaque puits d’une plaque préchauffée de 24 puits pour incuber à 37 degrés Celsius afin de permettre à la matrice du sous-sol de se solidifier pendant 10 à 15 minutes.
Plus tard, ajoutez 500 microlitres de milieu d’expansion organoïde pulmonaire à chaque puits et incubez dans un incubateur de culture cellulaire. Rafraîchissez le milieu tous les trois jours et passez les organoïdes toutes les deux semaines. Pour passer les organoïdes pulmonaires avec trypsinisation, ressuspendez les organoïdes pulmonaires prélevés dans un millilitre d’enzyme de dissociation.
Incuber l’organoïde dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu basal au tube et cisaillez mécaniquement les organoïdes en pipetant de haut en bas. Vérifiez la taille des pièces organoïdes au microscope à un grossissement de 100X avant de terminer la digestion avec 40 microlitres de sérum bovin fœtal.
Porter le volume à 10 millilitres avec le milieu basal et la centrifugeuse avant de remettre les pièces organoïdes dans une matrice de sous-sol froide avec un volume suffisant pour passer avec un rapport de 1:5 à 1:10. Plus tard, distribuez 40 microlitres de suspension organoïde dans chaque puits d’une plaque de 24 puits et cultivez la plaque comme démontré précédemment. Pour générer des organoïdes des voies respiratoires 3D, incuber les organoïdes pulmonaires dans le milieu d’expansion pendant sept à 10 jours après le passage par cisaillement mécanique.
Ensuite, remplacez le milieu d’expansion par un milieu de différenciation proximal et incubez les organoïdes dans un incubateur de culture cellulaire. Après 14 jours, jeter le milieu dans chaque puits et ajouter un tampon de lysat cellulaire pour prélever l’organoïde différencié des voies respiratoires pour l’extraction de l’ARN et la détection de l’expression des gènes cellulaires par test RT-qPCR. Pré-incuber les inserts dans l’incubateur de culture cellulaire avec 250 et 500 microlitres du milieu basal dans la chambre supérieure et inférieure d’une plaque de 24 puits, respectivement.
Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu basal au tube et pipetez de haut en bas pour cisailler les organoïdes en cellules individuelles. Observez les cellules au microscope avant de terminer la digestion avec 40 microlitres de sérum bovin fœtal. Filtrer les cellules à travers une passoire de 40 microns dans un tube de 50 millilitres et transférer la suspension cellulaire filtrée dans un tube de 15 millilitres.
Complétez la suspension avec un milieu basal jusqu’à un volume total de 10 millilitres. Après centrifugation, remettre en suspension la pastille recueillie à partir de 24 gouttelettes dans 1 à 2,5 millilitres de milieu d’expansion organoïde pulmonaire, selon la densité cellulaire. Comptez le nombre de cellules avec le compteur de cellules au microscope, puis ajustez la concentration cellulaire à 1,3 fois 10 à six par millilitre pour les inserts de 24 puits.
Retirez le milieu basal des chambres supérieure et inférieure avant d’ajouter 500 microlitres de milieu d’expansion dans la chambre inférieure. Ensemencez 100 microlitres de suspension cellulaire préparés plus tôt sur la chambre apicale de l’insert à 24 puits et incubez. Après deux jours, remplacez le milieu d’expansion par un milieu de différenciation proximal dans la chambre apicale et inférieure de la plaque.
Incuber les organoïdes pendant 14 jours et rafraîchir le milieu tous les trois jours. Mesurez la résistance électrique trans-épithéliale tous les jours à l’aide d’un système de mesure de la résistance électrique. Dans la microphotographie représentative, les cellules pulmonaires fraîchement isolées peuvent être vues incorporées dans la matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit de type deux.
Les organoïdes kystiques sont apparus et ont grandi au fil du temps. Les organoïdes pulmonaires après le quatrième passage sont démontrés ici. Dans les deux heures suivant le cisaillement mécanique, les fragments organoïdes incorporés dans l’extrait de la membrane basale ont formé les domaines kystiques.
La microphotographie du même champ le cinquième jour a confirmé la croissance organoïde au fil du temps. Les organoïdes en expansion abritaient les quatre principaux types de cellules épithéliales des voies respiratoires, y compris les cellules ciliées ACCTUB positives ou FOXJ1 positives, les cellules basales P63 positives, les cellules club CC10 positives et les cellules gobelet MUC5AC positives dans un état prématuré. Les organoïdes incubés dans le milieu d’expansion et de différenciation proximale ont développé une morphologie distincte au fil du temps.
Après deux semaines de différenciation dans le milieu de différenciation proximal, des cils mobiles étaient discernables dans chaque organoïde. Il a été observé que la célia battant de manière synchrone entraînait les débris cellulaires à l’intérieur de la lumière organoïde et les tourbillonnait unidirectionnellement pour éliminer les particules inhalées. En outre, l’analyse par cytométrie en flux a démontré que les organoïdes différenciés accueillaient quatre types de cellules épithéliales des voies respiratoires dans un milieu de différenciation et d’expansion proximal.
Après deux semaines de différenciation, les organoïdes des voies respiratoires 2D ont développé une barrière épithéliale intacte. Un test de blocage de dextran a été effectué pour évaluer l’intégrité de la barrière épithéliale formée dans les organoïdes des voies respiratoires 2D. Les organoïdes 2D contenaient des cellules ciliées abondantes.
L’organoïde pulmonaire extensible à long terme et l’organoïde différencié des voies respiratoires fournissent un système modèle physiologiquement actif et universel pour l’étude de la biologie et de la pathologie respiratoires, y compris la COVID-19.
