Le protocole présente diverses techniques de microscopie appliquées pour comprendre la colonisation fongique chez les plantes mycohétérotrophes, de la collecte à la préparation des échantillons en détail et comprend des étapes essentielles. De telles techniques peuvent être appliquées à diverses plantes mycohétérotrophes, et même à des matériaux d’une plante autres que mycohétérotrophes. Cette méthode est principalement liée à la botanique structurale et pourrait également fournir des informations sur les interactions mycorhiziennes, la physiologie, la biologie de la reproduction, l’évolution et l’écologie des plantes mycohétérotrophes.
Pour commencer, collectez les plantes mycohétérotrophes en explorant le sol autour de la base végétale, en prenant soin de ne pas endommager les organes souterrains. Évitez également de tirer les plantes du sol pour éviter de déconnecter les organes aériens des organes souterrains. Creusez soigneusement autour des structures aériennes à l’aide d’une truelle de jardinage tout en explorant les organes souterrains comme les racines, les tiges, les rhizomes et les organes de stockage sans endommager ces structures.
Enlevez les particules de sol pour préserver les structures fragiles et lavez délicatement ces organes à l’eau du robinet pour rincer les particules de sol restantes avant de fixer les échantillons. Les plantes mycohétérotrophes associées à la litière de feuilles exigent une attention particulière. Par conséquent, collectez soigneusement les organes délicats connectés au matériau en décomposition à travers leurs hyphes sans les extraire des structures connectées.
Préservez les structures avec de telles connexions et ramassez la litière pour analyse. Pour l’analyse par microscopie électronique à transmission, sectionner les échantillons de 3 à 4 millimètres d’épaisseur à l’intérieur d’une goutte de tampon de cacodylate de sodium de glutaraldéhyde en sections plus petites de 1 à 2 millimètres d’épaisseur. Jetez les bords coupés à l’extérieur de la goutte.
S’assurer que le processus de fixation est effectué sur le site de collecte immédiatement après la collecte des plantes. Transférer immédiatement les sections dans un tube collecteur avec un volume de fixateur plus de 10 fois supérieur au volume des échantillons car il s’agit d’un fixateur additif. Pour l’analyse de surface des hyphes superficiels dans les organes, en particulier dans les organes souterrains et ceux en contact avec la litière de feuilles.
Observez le matériel frais ou fixe au microscope à dissection à un grossissement de 7,5x ou plus. Recherchez les zones d’intérêt guidées par les hyphes superficiels et les rhizomorphes. Sélectionner les échantillons contenant des zones de rhizomorphes superficiels, car ceux-ci peuvent être sectionnés pour visualiser les pelotons et les serpentins d’hyphes dans les cellules corticales des racines et des tiges.
Préparer 0,2 milligramme par millilitre de conjugué fluorochrome agglutinine de germe de blé et 1% de calcofluor blanc dans 0,1 molaire tampon phosphate comme décrit dans le manuscrit. Maintenant, incuber les sections sur des lames de verre en les recouvrant correctement d’une solution conjuguée fluorochrome d’agglutinine de germe de blé pendant 30 minutes. Après l’incubation, laver les sections avec un tampon phosphate 0,1 molaire et les incuber dans la solution de calcofluor comme milieu de montage.
Ensuite, placez les couvercles sur les lames et observez-les sous un microscope confocale ou à fluorescence à l’aide des filtres indiqués. Après avoir fixé les échantillons, effectué la déshydratation et stocké dans de l’éthanol à 70%, exposez toute surface souhaitée pour l’analyse par microscopie électronique à balayage en utilisant une lame de rasoir tranchante et nouvelle pour effectuer des coupes avec un mouvement unidirectionnel. Si nécessaire, utilisez un stéréomicroscope pour sélectionner les échantillons et tenir compte de la zone des souches métalliques lors de la détermination de la taille des échantillons.
En outre, déshydrater les échantillons dans une série éthanolique. Conservez les échantillons petits et délicats pendant 30 minutes à chaque concentration et les échantillons plus grands et plus denses pendant 1 heure. Ensuite, pliez de petites enveloppes à l’aide de papier de soie pour organiser les échantillons pour les étapes suivantes.
Les échantillons plus volumineux peuvent être manipulés sans enveloppe. Étiquetez les enveloppes à l’aide d’un crayon et tenez un journal des échantillons. Placez soigneusement les échantillons à l’intérieur des enveloppes à l’aide d’un pinceau.
Maintenant, conservez ces échantillons dans de l’éthanol absolu. Procéder immédiatement au séchage au point critique en faisant fonctionner un sécheur à point critique conformément aux procédures d’exploitation normalisées. Pour cela, placez les échantillons dans de l’éthanol absolu dans un porte-échantillon et placez-le à l’intérieur de la chambre de pression du sécheur à point critique.
Le fluide intermédiaire se dissout dans le fluide de transition au point critique de dioxyde de carbone, asséchant ainsi les échantillons. Comme la réabsorption de l’humidité atmosphérique peut détruire les échantillons, les stocker dans un récipient de dessiccation immédiatement après le séchage au point critique. Avant de monter les échantillons sur des bouts métalliques, mettez les gants pour manipuler les talons.
Plongez-les dans l’acétone pendant 5 minutes pour éliminer toute graisse et laissez-les sécher. Au microscope stéréoscopique, fixez les échantillons sur la souche à l’aide d’un ruban adhésif de carbone conducteur double face et positionnez-les. Le site d’en haut est la seule perspective possible pour balayer des images de microscopie électronique.
Pour manipuler les échantillons, utilisez une pince à épiler à pointe fine. La partie de l’échantillon touchée par la pince à épiler est généralement endommagée. Soyez donc prudent et essayez de toucher les pièces positionnées loin des zones d’intérêt.
Maintenir les souches avec les échantillons dans une boîte de Petri scellée avec du gel de silice. Ensuite, procédez au revêtement par pulvérisation pour déposer une couche d’or ou de platine à la surface des échantillons dans une atmosphère à basse pression de gaz inerte en suivant les procédures opératoires standard. L’épaisseur du revêtement dépend de la topographie de l’échantillon et se situe généralement entre 15 et 40 nanomètres.
Enfin, maintenez les tiges enrobées dans une boîte de Petri scellée avec du gel de silice retenant l’humidité. Les échantillons peuvent être stockés de cette façon pendant des semaines. Utilisez un microscope électronique à balayage pour analyser ces échantillons.
Un faisceau d’électrons frappe l’échantillon sous vide pendant la microscopie électronique à balayage et l’émission de signal provenant d’une telle interaction est interprétée comme des images. S’assurer que les solutions et les matériaux utilisés dans la germination symbiotique des graines sont stériles. pour éviter la contamination.
Commencez par les autoclaver pendant 20 minutes à 121 degrés Celsius. Dans une hotte à flux d’air laminaire, désinfecter superficiellement les fruits et les graines en les immergeant dans une solution d’hypochlorite de sodium contenant 2% de chlore actif. Les graines minces et fragiles peuvent être immergées dans une solution d’hypochlorite de sodium dilué 1:1.
Après désinfection, récupérez les graines en les filtrant à l’aide d’un tissu xérographique. Lavez les fruits et les graines trois fois dans de l’eau distillée autoclavée pour éliminer la solution d’hypochlorite avant de procéder aux tests de germination. Si nécessaire, conservez-les dans des enveloppes en papier filtre à l’intérieur de flacons en verre avec du gel de silice à 4 degrés Celsius et fermez hermétiquement les flacons et scellez-les avec un film alimentaire, puis évaluez l’efficacité du processus de lavage en transférant quelques gouttes d’eau du dernier lavage sur gélose au dextrose de pomme de terre.
Pour la germination symbiotique des graines d’orchidées, incuber les graines sur des disques de papier filtre autoclavés de 1 à 2 centimètres placés dans des boîtes de Petri contenant un milieu de culture en gélose à l’avoine. Maintenant, inoculez le centre de la boîte de Petri avec le fragment de milieu de culture contenant du mycélium du champignon isolé choisi. Scellez les boîtes de Petri avec un film alimentaire et incuberez-les dans l’obscurité à environ 25 degrés Celsius ou température ambiante, selon la croissance fongique.
Préparez des plats avec des graines et sans inoculation fongique comme témoin négatif pour le test de germination. Analyser les résultats de germination chaque semaine en recueillant des données quantitatives et qualitatives et en photographiant les protocormes et les semis. Les rhizomorphes peuvent être facilement reconnus généralement comme des structures sombres ressemblant à des structures de type restreint.
Les méthodes à main levée ou autres méthodes d’obtention de sections de plus de 10 micromètres d’épaisseur peuvent mieux mettre en évidence les pelotons et fournir des images plus représentatives des modèles fongiques de colonisation. Les sections à main levée peuvent également convenir à l’analyse des hyphes en amplification plus élevée. Cependant, les détails sont mieux réalisés dans des sections plus minces.
Les parois cellulaires secondaires dans les éléments du xylème peuvent être facilement identifiées par la couleur claire acquise par la toluidine. Pendant ce temps, les éléments du phloème composés uniquement de parois cellulaires primaires sont identifiés par leurs parois cellulaires plus minces et plus sombres. Des artefacts par autofluorescence peuvent être vus dans les sections de résine de méthacrylate de glycol.
Ces artefacts sont généralement liés à la concentration de fluorochrome et peuvent être évités en lavant les échantillons un plus grand nombre de fois avec le tampon. La section à main levée de la racine montre les hyphes internes et externes. Le même organe peut être vu en microscopie électronique à balayage avec une abondance de rhizomorphes et d’hyphes individuels à sa surface.
La plupart des espèces d’orchidées germent quelques semaines après avoir été infectées par le champignon inoculé ou jusqu’à près d’un mois. La lumière en microscopie électronique à balayage peut être appliquée aux fleurs, aux fruits et aux graines pour étudier la biologie de la reproduction ou les plantes mycohétérotrophes. La germination symbiotique des graines peut également être testée chez les orchidées autotrophes.
