The kindness and generosity of Dr. Kent McDonald of UC Berkeley are greatly appreciated. We thank an anonymous reviewer for very helpful suggestions. The Burch-Smith lab is supported by start-up funds from the University of Tennessee.

NOTE: La procédure de QFS nécessite beaucoup de soins et de prudence par l&#39;utilisateur et nous mettons en évidence les consignes de sécurité ici comme précautions et remarques le cas échéant. 1.PRÉPARATION pour HPF Run <ol><li> Avant de commencer la préparation des échantillons, mettez au congélateur à haute pression en suivant les instructions du fabricant. REMARQUE: L&#39;unité HPF utilisé dans ce protocole est une unité Wohlwend Compact 02 (figure 1A), et il faut environ une heure à une heure et demi de procédure de démarrage avant HPF va peut commencer. <ol><li> Mise en marche du Wohlwend Compact 02 haute pression Congélateur. <ol><li> Allumez l&#39;appareil en tournant l&#39;interrupteur principal de &quot;0&quot; à &quot;1&quot;. </li><li> Libérer l&#39;air comprimé de la machine. </li><li> Relâcher l&#39;azote liquide à l&#39;appareil. </li><li> Appuyez sur la touche &quot;SYSTEM tarir&quot;. </li><li> Après 30 minutes, appuyez sur le «SYSTENouveau sur la touche M tarir &quot;. </li><li> Appuyez sur la touche &quot;ON / OFF&quot; pour allumer l&#39;appareil. </li><li> Appuyez sur le bouton «azote». </li><li> Laissez la machine refroidir pendant 20 minutes, même si le &quot;DRIVE IN&quot; bouton a déjà allumé. </li><li> Le &quot;DRIVE IN&quot; de la touche s&#39;allume. </li><li> Appuyez sur le &quot;DRIVE IN&quot; bouton. </li><li> Appuyez sur le bouton «AUTO». </li><li> Les «système prêt&quot; bouton s&#39;allume. </li><li> Placer la sonde de température et de pression dans la chambre de pression et le verrouiller avec la broche. </li><li> Appuyez sur le bouton &quot;JET AUTO&quot;. Cette étape vérifie que l&#39;augmentation de la pression et la température diminuent sont comme vous le souhaitez; essentiellement un essai. Les fortes baisses de température et de fortes augmentations de la pression sont attendus (figure 1B). </li><li> Effectuer deux autres cycles de JET. </li></ol></li></ol></li></ol> 2 Préparation pour ReceiviLes échantillons congelés ng <ol><li> Remplissez une boîte isolée contenant détenteurs cryovial avec de l&#39;azote liquide (voir Mises en garde de sécurité), de sorte que les détenteurs sont complètement couverts (figure 1C). REMARQUE: Utiliser PPE y compris Cryogants et des lunettes lors de la manipulation de l&#39;azote liquide. </li><li> Placer le nombre approprié de flacons contenant le milieu FS dans les supports de tubes d&#39;aluminium dans l&#39;azote liquide (Figure 1C). Avec ce protocole jusqu&#39;à quatre disques contenant chacune un seul échantillon peut être placé dans un tube cryogénique. REMARQUE: Les flacons doivent être étiquetés avec un instrument tranchant comme un scribe à pointe de diamant et un crayon très gras. <ol><li> Pour fixateur pendant QFS utiliser 1% OsO 4 et 0,1% d&#39;acétate d&#39;uranyle dans l&#39;acétone 9. Préparer la solution à grand volume, distribuer des aliquotes de 1,5 ml dans les tubes cryogéniques et les conserver congelés dans l&#39;azote liquide. REMARQUE: Suivez les avertissements de sécurité pour la manipulation OSO4 et de l&#39;acétate d&#39;uranyle. REMARQUE: OSO4 </sub&gt; et de l&#39;acétate d&#39;uranyle sont des produits chimiques dangereux et doivent être manipulés dans la hotte tout en portant des équipements de protection individuelle (EPI), y compris des chaussures fermées à embout, blouse de laboratoire et des gants. REMARQUE: Les tubes cryogéniques utilisés pour contenir des échantillons pour QFS doit avoir un joint torique dur pour s&#39;assurer que les tubes restent scellés pendant QFS pour éviter les fuites de OSO4. </li></ol></li><li> Préparer la pâte de levure en mélangeant la levure de boulangerie avec un volume à peu près égal à 10% de methanol avec un cure-dent ou un autre instrument jusqu&#39;à ce que la pâte soit homogène. La pâte de levure agit comme un agent cryoprotecteur extracellulaire et est utilisée pour remplir l&#39;espace autour de l&#39;échantillon dans le porte-échantillon. La quantité de pâte dépend du nombre d&#39;échantillons; pour 10 échantillons ou moins la pâte (1 ml) peuvent être mélangés dans un tube à centrifuger. </li></ol> 3. haute pression de congélation des échantillons <ol><li> Retirer une feuille (ou d&#39;autres tissus) d&#39;intérêt de la plante et placez-le doucement sur un morceau de dental cire ou autre surface de coupe. Utiliser un poinçon de 2,0 mm ou la taille souhaitée pour couper un échantillon de la feuille. Manipuler l&#39;échantillon doucement avec une paire de pinces et de travailler le plus rapidement possible. </li><li> Travailler sous un microscope de dissection, placez le disque de feuille sur le côté de 0,2 mm de type A de support de l&#39;échantillon et couvrir complètement dans la pâte de levure. Assurez-vous que le disque est complètement rempli, et la pâte est de niveau avec le bord du support en lissant la pâte avec un pinceau fin (figure 2). </li><li> Placer le support dans le porte-échantillon. Couvrir l&#39;échantillon avec le support de spécimen de type B, surface plate. REMARQUE: Le porte-échantillon doit être sec et à température ambiante. </li><li> Prenez échantillon dans le porte-échantillon, l&#39;insérer dans la machine et lancer un cycle de congélation en appuyant sur le bouton &quot;JET AUTO&quot;, qui devrait terminer en une seconde ou deux. </li><li> Travailler le plus rapidement possible, retirez le support de la machine et placer la pointe maintenant le sample dans de l&#39;azote liquide dans la caisse isotherme au-dessus de la machine HPF. Plonger les pointes des deux paires de pinces dans l&#39;azote liquide pour les refroidir. NOTE: Après le gel, les transporteurs ne doivent être manipulés avec des pinces d&#39;azote liquide refroidi. Chauds (température ambiante) forceps sont souvent la cause de l&#39;échec dans cryotechniques. </li><li> Ouvrez un tube cryogénique contenant le support FS, et placer le couvercle sur le côté de la boîte. A l&#39;aide d&#39;une paire de forceps de l&#39;azote liquide refroidi, retirer doucement le disque du porte-échantillon, en veillant à ce que le disque est toujours dans l&#39;azote liquide ou de la vapeur. Travailler dans la vapeur d&#39;azote liquide, tenir le tube de FS avec une pince pré-refroidissement et utiliser l&#39;autre pour placer le support dans le flacon de FS. Vissez le bouchon du flacon de FS en marche. Ne pas coincer tout l&#39;azote liquide dans le flacon. REMARQUE: Lors du transfert des échantillons de tubes cryogéniques pour QFS, veillent à ce qu&#39;aucune azote liquide est piégé dans les flacons. L&#39;azote liquide se dilate 700 fois pendant le réchauffement et une trapped azote liquide peut provoquer des explosions pendant ce temps. </li><li> Répétez les étapes 3.1 à 3.7 jusqu&#39;à ce que tous les échantillons souhaités sont gelés. Des disques de feuilles multiples qui contiennent le même type d&#39;échantillon peuvent être placées dans le même flacon. A noter que le porte-échantillon doit être séché et amené à la température ambiante entre pistes congélation. Pour ce faire vite, chauffer avec un sèche-cheveux, et de surveiller la température par le toucher. </li></ol> 4 Préparation de gel Remplacement <ol><li> Immerger complètement le bloc chauffant en aluminium dans de l&#39;azote liquide pendant 10 min ou jusqu&#39;à ce que les arrêts d&#39;ébullition nucléée. Bien que ce qui se passe, placer une couche de neige carbonique (1-2 cm) dans le fond du récipient utilisé comme chambre FS (figure 3). Un contenant en styromousse ou seau à glace peuvent être utilisés pour FS, avec de la glace sèche ou des granules écrasés. </li><li> Insérer rapidement des cryotubes contenant les échantillons en même temps que la sonde de température dans les rangées du milieu du bloc de chauffage. Assurez-vous que les couvercles sur leles flacons sont hermétiquement vissé sur le support de sorte que FS ne fuit pas lors de FS. Commencer l&#39;enregistrement de la température. <ol><li> Ajouter la sonde de température en plaçant un thermocouple à travers le sommet d&#39;un tube cryogénique afin qu&#39;il atteigne le fond du tube. Sceller le couvercle du tube avec une résine de sorte qu&#39;aucune fuite de liquide hors. Remplir le tube avec 1,5 ml d&#39;acétone au début de chaque cycle de SFT. </li></ol></li><li> Utilisation Cryogants isolés ou de grandes pinces, verser tout l&#39;azote liquide à partir du bloc chauffant. Prenez soin de ne pas verser les cryotubes. REMARQUE: Utiliser PPE y compris Cryogants et des lunettes lors de la manipulation de l&#39;azote liquide. </li><li> Placez le bloc contenant les flacons sur la couche de glace sèche dans la chambre de l&#39;EFT. Assurez-vous que le bloc est placé de telle sorte que les tubes sont couchés à l&#39;horizontale, mais avec une légère inclinaison vers le haut. Il devrait y avoir aucune fuite si les cryotubes sont utilisées. </li><li> Emballez la chambre de l&#39;EFT avec de la glace sèche de sorte que les tubes de FS sont couvertes, même s&#39;il n&#39;est pas nécessaire derecouvrir la partie supérieure du bloc. Placer le couvercle sur la chambre. </li></ol> 5. rapide FS REMARQUE: Effectuer la course de l&#39;EFT dans une hotte dans le cas où une fuite de OSO4 se produit par inadvertance en dépit d&#39;autres précautions. <ol><li> Passer chambre QFS sur un agitateur rotatif de plate-forme dans une hotte de laboratoire et tourner à 125 tours par minute pendant 120 minutes. Pendant ce temps, la température du bloc devrait augmenter progressivement jusqu&#39;à environ -80 ° C. L&#39;agitation assure le mélange des composants pour de meilleures FS. REMARQUE: La mise en place de l&#39;agitateur dans la hotte et la position de la porte de la hotte doit être le même tout au long de la procédure de l&#39;EFT et pour tous les QFS gérées pour assurer le réchauffement uniforme des échantillons. </li><li> Retirez la glace sèche de la chambre et continuer agitation pendant une heure. REMARQUE: la température devrait augmenter à environ -15 ° C à -20 ° C. </li><li> Retirer les échantillons et de la sonde de température de la chambre de SFT et le placer sur laagitateur à la température ambiante pendant 10 à 15 min un autre, jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent la température ambiante. Arrêter l&#39;enregistrement de la température. </li><li> Au cours de FS, éteindre la machine HPF. <ol><li> Fermer le robinet du réservoir d&#39;azote liquide pendant que la machine HPF est rempli d&#39;azote. </li><li> Appuyez sur le bouton «azote». </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce que les &quot;piston vers le bas&quot; s&#39;éteint la lumière rouge. </li><li> Appuyez sur la touche &quot;ON / OFF&quot;. </li><li> Appuyez sur la touche &quot;SYSTEM tarir&quot;. </li><li> Couper l&#39;alimentation de l&#39;air comprimé à la machine. </li><li> Après un minimum de 12 heures (pour assurer un séchage de l&#39;humidité), éteindre la machine en mettant l&#39;interrupteur principal de &quot;1&quot; à &quot;0&quot;. </li></ol></li></ol> 6. Poster FS traitement <ol><li> Retirez délicatement les médias FS avec des pipettes de transfert plastique et les placer dans le conteneur approprié pour les déchets toxiques. REMARQUE: OSO4 et de l&#39;acétate d&#39;uranyle sont des substances chimiques dangereuseset doivent être manipulés dans la hotte tout en portant des équipements de protection individuelle (EPI), y compris des chaussures fermées à embout, blouse de laboratoire et des gants. </li><li> Échantillons Laver quatre fois avec 100% d&#39;acétone. Recueillir les deux premiers lavages et placer dans le conteneur de déchets toxiques. </li><li> En utilisant des pinces fines, retirer les échantillons de tissus provenant de porteurs. Conserver les échantillons humide avec de l&#39;acétone comme cela est fait, et travailler très doucement pour éviter la rupture des échantillons. NOTE: Il n&#39;est pas rare et il peut effectivement être utile d&#39;avoir la pâte de levure tomber loin des échantillons à ce stade. La pâte de levure est habituellement brun très foncé alors que le tissu de la feuille est encore verte. </li><li> Recueillir les échantillons dans des cryotubes contenant de l&#39;acétone. Procéder à la préparation de l&#39;échantillon (infiltration et intégration) pour TEM selon les protocoles habituels. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

The success of the protocol presented here depends heavily on the user. First, advanced preparation is required to ensure that all necessary materials are readily available and in sufficient quantity to complete an entire HPF-QFS run. Second, the user must work quickly, moving from step-to-step in an efficient manner that minimizes sample handling, thus minimizing changes to the native state of the tissue. Once samples are frozen and before they are dehydrated it is imperative that they be kept cold, so care must be take...

Notre connaissance de l&#39;ultrastructure cellulaire provient principalement de la microscopie électronique, qui peut résoudre les détails de l&#39;ordre de quelques nanomètres 1. En dépit d&#39;être si puissant dans la résolution TEM n&#39;est pas considéré comme convivial, comme la préparation de l&#39;échantillon nécessite beaucoup de temps et protocoles laborieux et exige une certaine expertise du praticien. Fixation traditionnelle des échantillons a combiné l&#39;utilisation d&#39;aldéhydes et de tétroxyde d&#39;osmium avant tout autre traitement qui comprend la déshydratation, l&#39;intégration dans de la résine, puis la coupe à réaliser des coupes ultra-minces qui sont ensuite colorés par des métaux lourds. Cependant, il est connu que la fixation chimique peut produire des artefacts, y compris l&#39;agrégation des protéines et la perte de lipides 1, et les variations qui affectent les membranes à plusieurs compartiments cellulaires en fin de compte deux. Ces objets sont en grande partie attribuables à la lenteur de la fixation et de la déshydratation à la température ambiante 3, 4, 5. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; cryofixation par congélation haute pression (HPF) évite la plupart des artefacts causés par la fixation chimique. Le principe de cryofixation est qu&#39;il abaisse le point de congélation de l&#39;eau de 20 degrés, ralentit la germination et la croissance des cristaux de glace et augmente la viscosité de l&#39;eau dans un échantillon biologique, de sorte que les constituants cellulaires sont essentiellement immobilisées 6, 7. HPF diminue un la température de l&#39;échantillon à celle de l&#39;azote liquide, sous très haute pression (210 MPa ou 2100 bars) en millisecondes. Une fois fait correctement HPF empêche la formation de gros cristaux de glace qui peuvent causer des dommages importants à l&#39;ultrastructure cellulaire. HPF peut être utilisé pour fixer des échantillons de 100 à 200 um d&#39;épaisseur, à des concentrations typiques de solutés biologiques 7. Il ya de nombreux commentaires sur la physique et les principes sous-jacents HPF, par exemple, 1, 7, 8. Après HPF, les échantillons sont incubés à basse température (-78,5 ° C à -90 &amp;N ° 176, C) en présence de solvants liquides contenant des fixateurs chimiques organiques tels que le tétroxyde d&#39;osmium, généralement pendant quelques jours. A cette température basse, l&#39;eau dans l&#39;échantillon est remplacé par le solvant organique, typiquement le methanol ou l&#39;acétone 1, 9. Ainsi, ce processus est appelé substitution de gel (FS). L&#39;échantillon est ensuite chauffé progressivement et pendant ce temps est fixé, le plus souvent avec du tétroxyde d&#39;osmium et de l&#39;acétate d&#39;uranyle 9. La reticulation à basse température présente l&#39;avantage de fixer des molécules qui sont immobilisées 1. FS produit donc des échantillons de qualité supérieure par rapport à celles qui sont fixées par fixation chimique classique à température ambiante, en particulier, il en résulte une meilleure préservation ultrastructurale, une meilleure conservation de l&#39;antigénicité et de réduction de la perte de composants non liés cellulaires 10, 11. La plupart des FS est réalisée sur de longues périodes, typiquement jusqu&#39;à plusieurs jours. Ceci est particulièrement true pour les plantes échantillons 12, 13, 14. Un récent protocole développé par McDonald et Webb réduit considérablement le temps de FS de quelques jours à quelques heures 15. Dans leur procédure rapide substitution de gel (SFT), FS est effectuée plus de 3 heures, alors que dans les FS ultra rapides (SQFS) les échantillons sont traités en 90 minutes. La qualité des échantillons produits par ces méthodes est comparable à ceux produits par des protocoles de service fixe traditionnels. Nous avons adopté le protocole de l&#39;EFT pour le traitement en aval des échantillons de plantes après HPF. Cela s&#39;est avéré pour sauver non seulement du temps mais aussi de l&#39;argent, comme l&#39;EFT et SQFS utilisent de l&#39;équipement de laboratoire commun au lieu de les coûteuses machines disponibles dans le commerce FS. Les tissus végétaux sont souvent très difficiles à préparer pour la MET. En moyenne, les cellules végétales sont plus grandes que soit des cellules bactériennes ou animales. La présence de la cuticule cireuse hydrophobe, des parois cellulaires épaisses, de grandes vacuoles remplies d&#39;eau contenant des acides organiques, des hydrolases phénolique et compounds que peut occuper jusqu&#39;à 90% du volume total de la pile 16, et la présence d&#39;espaces aérés diminue fortement la conductivité thermique du système 17. En outre, dans le cas des plantes, l&#39;épaisseur de l&#39;échantillon dépasse presque toujours 20 pm, la limite d&#39;utilisation de la fixation chimique. A ces épaisseurs, la faible conductivité thermique de l&#39;eau empêche un taux de gel de plus de -10 000 ° C / sec dans le centre de l&#39;échantillon. Ce taux est nécessaire pour éviter la formation de glace hexagonale dommageable (cristaux de glace avec une densité plus faible et plus de 10 à 15 nm) 8. Ensemble, ces défis présents à la fois une bonne congélation de l&#39;échantillon et FS ultérieures. Néanmoins, cryofixation est la meilleure méthode pour la fixation des échantillons de plantes. Ici, un protocole pour HPF-EFT d&#39;échantillons de tissus de plantes sont présentées. Il est centré sur l&#39;espèce modèle Arabidopsis thaliana, mais a aussi été utilisé avec Nicotiana benthamiana. Les résultats montrent que les caractéristiques HPF-SFT produit samples de qualité comparable à HPF-FS traditionnels dans une fraction du temps. Avec les ajustements nécessaires, ce protocole peut également être utilisé pour d&#39;autres échantillons biologiques relativement épais.

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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:245px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">HPF02</td>
			<td>With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display&#160; of freezing parameters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">241-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">242-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20</td>
			<td style="width:245px;">Chart</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Baker&#39;s yeast</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Tooth picks</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Thermocouple data logger EL-USB-TC</td>
			<td style="width:245px;">OMEGA Engineering Inc.</td>
			<td style="width:119px;">OM-EL-USB-TC&#160;</td>
			<td>Replacement battery purchased separately</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">34505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Heater block 12/13 mm</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Rotary shaker</td>
			<td style="width:245px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-402-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Leaf punch - Harris Uni-core 2.00</td>
			<td style="width:245px;">Ted-Pella Inc.</td>
			<td style="width:119px;">15076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Pink dental wax</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Cryogenic vials 2 mL</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">61802-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Methanol</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Blow dryer</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Dry ice</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Acetone</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Forceps</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Several pairs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy

Depuis la microscopie électronique à transmission de 1940 (TEM) a fourni des biologistes avec des images ultra-haute résolution de matériaux biologiques. Pourtant, en raison de protocoles laborieux et de longue haleine qui exigent également de l&#39;expérience dans la préparation des échantillons sans artefact, TEM n&#39;est pas considérée comme une technique facile à utiliser. Préparation de l&#39;échantillon traditionnel pour la TEM fixateurs chimiques pour préserver les structures cellulaires. Congélation à haute pression est la cryofixation d&#39;échantillons biologiques sous des pressions élevées pour produire des taux de refroidissement très rapide, limitant ainsi la formation de glace, ce qui est préjudiciable à l&#39;intégrité de l&#39;ultrastructure cellulaire. Congélation à haute pression et la substitution de gel sont actuellement les méthodes de choix pour la production de la morphologie de la plus haute qualité dans les sections de résine pour TEM. Ces méthodes de minimiser les artefacts normalement associés à un traitement classique pour la MET de coupes fines. Après cryofixation l&#39;eau gelée dans l&#39;échantillon liquide est remplacée parsolvant organique à basse température, un procédé appelé substitution de gel. Substitution gel est généralement effectuée sur plusieurs jours dans dédiée, des équipements coûteux. Une innovation récente permet que le processus soit terminé en trois heures, au lieu des deux habituelles jours. Ceci est généralement suivi par plusieurs jours de préparation de l&#39;échantillon qui comprend l&#39;infiltration et l&#39;intégration dans les résines époxy avant la coupe. Nous présentons ici un protocole combinant congélation à haute pression et la substitution de congélation rapide qui permet usine échantillon fixation à accomplir en quelques heures. Le protocole peut être facilement adapté pour travailler avec d&#39;autres tissus ou des organismes. Les tissus végétaux sont particulièrement préoccupantes en raison de la présence d&#39;espaces aérés et vacuoles remplies d&#39;eau qui empêchent la congélation libre de glace d&#39;eau. En outre, le procédé de fixation chimique est d&#39;autant plus longtemps dans les plantes en raison de parois cellulaires qui empêchent la pénétration des produits chimiques à l&#39;intérieur des tissus profonds. Les tissus végétaux sont donc particrement difficile, mais ce protocole est fiable et fournit des échantillons de la plus haute qualité.

Les résultats présentés ci-dessous ont été obtenus en utilisant un Compact Wohlwend 02 pour HPF (figure 1A). Un avantage majeur de cet instrument est la facilité d&#39;utilisation des supports de spécimens et de ses détenteurs. Lors de l&#39;utilisation d&#39;autres instruments, McDonald recommande que deux utilisateurs doivent procéder à la préparation des échantillons et HPF, un préparation des échantillons tandis que l&#39;autre ne le gel et le transfert de la FS Cryotubes 9....

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Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem de congélation à haute pression et rapide Gel Remplacement de tissus végétaux pour microscopie électronique à transmission

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

tandem-high-pressure-freezing-quick-freeze-substitution-plant-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K vues.  University of Tennessee, Knoxville. Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Vidéo: Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated to generate a carbon/platinum &#8220;cast&#8221; intended for examination by transmission electron microscopy. Specimens are subjected to ultrarapid freezing rates, often in the presence of cryoprotective agents to limit ice crystal formation, with subsequent fracturing of the specimen at liquid nitrogen cooled temperatures under high vacuum. The resultant fractured surface is replicated and stabilized by evaporation of carbon and platinum from an angle that confers surface three-dimensional detail to the cast. This technique has proved particularly enlightening for the investigation of cell membranes and their specializations and has contributed considerably to the understanding of cellular form to related cell function. In this report, we survey the instrument requirements and technical protocol for performing freeze-fracture, the associated nomenclature and characteristics of fracture planes, variations on the conventional procedure, and criteria for interpretation of freeze-fracture images. This technique has been widely used for ultrastructural investigation in many areas of cell biology and holds promise as an emerging imaging technique for molecular, nanotechnology, and materials science studies.

Basic techniques and refinements of freeze-fracture processing of biological specimens and nanomaterials for examination by transmission electron microscopy are described. This technique is a preferred method for revealing ultrastructural features and specializations of biological membranes and for obtaining ultrastructural level dimensional and spatial data in materials sciences and nanotechnology products.

Éléments techniques fondamentales de cryofracture / Gel-gravure dans biologique Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Recherche

Biologie

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

L&#39;étude de l&#39;Organisation supramoléculaire de photosynthétiques Membranes dans les tissus foliaires Gel fracturés par Cryo-microscopie électronique à balayage

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

Plunge congélation: un outil pour les études ultrastructurales et immunolocalisation de cellules en suspension dans microscopie électronique à transmission

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Microscopie électronique à balayage (MEB) Protocoles pour Problematic plantes, Oomycètes et échantillons Fungal

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and spatial resolution on the order of ms and nm, respectively. We have developed a time-resolved electron microscopy technique, &#34;flash-and-freeze,&#34; that induces cellular events with optogenetics and visualizes the resulting membrane dynamics by freezing cells at defined time points after stimulation. To demonstrate this technique, we expressed channelrhodopsin, a light-sensitive cation channel, in mouse hippocampal neurons. A flash of light stimulates neuronal activity and induces neurotransmitter release from synaptic terminals through the fusion of synaptic vesicles. The optogenetic stimulation of neurons is coupled with high-pressure freezing to follow morphological changes during synaptic transmission. Using a commercial instrument, we captured the fusion of synaptic vesicles and the recovery of the synaptic vesicle membrane. To visualize the sequence of events, large datasets were generated and analyzed blindly, since morphological changes were followed in different cells over time. Nevertheless, flash-and-freeze allows the visualization of membrane dynamics in electron micrographs with ms temporal resolution.

We developed a novel technique in electron microscopy, &#34;flash-and-freeze,&#34; that enables the visualization of membrane dynamics with ms temporal resolution. This technique combines the optogenetic stimulation of neurons with high-pressure freezing. Here, we demonstrate the procedures and describe the protocols in detail.

Flash et Gel: Une nouvelle technique pour capturer la membrane dynamique avec la microscopie électronique

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Préparation des échantillons et l’imagerie des Exosomes par microscopie électronique à Transmission

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Préparation de l’échantillon miniaturisé pour la microscopie électronique à Transmission

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Préparation de l’échantillon biologique par congélation à haute pression, amélioration du contraste assistée par micro-ondes et minime résine enrobage pour l’imagerie de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Préparation de grille cryo-microscopique électronique pour des études résolues dans le temps à l’aide d’un nouveau système robotique, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.