La méthode MycoPatt permet une exploration approfondie de la colonisation mycorhizienne arbusculaire dans les racines. Les cartes mycorhiziennes indiquent l’expansion fongique et présentent la position réelle de chaque structure comme un modèle spécifique. La colonisation mycorhizienne est analysée objectivement à une résolution de 1%.
Chaque segment racine est automatiquement converti en matrice numérique et génère une vaste base de données de paramètres de colonisation. Pour commencer, retirez les racines du réfrigérateur et placez-les sur une plate-forme de travail pour les décongeler à température ambiante. Pour effectuer le nettoyage des racines, placez toutes les racines d’une plante dans un pot de 30 à 50 millilitres, puis préparez une solution d’hydroxyde de sodium à 10% avec de l’eau du robinet et versez-la dans le pot jusqu’à ce qu’elle recouvre complètement les racines.
Agiter vigoureusement le pot pendant une à deux minutes pour une dispersion homogène de la solution de nettoyage dans les racines. Laissez les racines rester dans la solution de défrichage pendant 48 heures. Pour le rinçage des racines, passez le contenu du pot à travers un tamis.
Rincer les racines plusieurs fois à l’eau du robinet jusqu’à ce que la solution de nettoyage soit complètement éliminée. Ensuite, placez les racines rincées dans un bocal propre pour les colorer. Ensuite, préparez une solution de vinaigre d’encre à cinq à cinq pour cent avec de l’eau du robinet.
Versez-le dans le bocal jusqu’à ce qu’il recouvre les racines et secouez-le pendant une à deux minutes. Après 48 heures pour une décoloration partielle, rincer les racines tachées à l’eau du robinet pendant une à deux minutes. Secouez vigoureusement le pot pour enlever la solution de coloration supplémentaire.
Répétez la procédure jusqu’à ce que les racines soient claires pour l’évaluation microscopique. Pour la segmentation des racines, placez les racines tachées sur une planche à découper écaillée. Coupez les racines en segments d’un centimètre.
Choisissez 15 segments pour chaque variante. Ensuite, étalez les racines sur une lame pour la préparation des segments, utilisez une poche de laminage pour couvrir les racines et écrasez-les doucement, en commençant par un bord. Utilisez un outil en plastique souple pour afficher les racines sur la lame.
Retirez délicatement la pochette de laminage et recouvrez l’échantillon d’un bordereau de couverture. Ajoutez de l’eau dans un coin de la lame avec une pipette et laissez l’eau se répandre lentement sur la glissière. Retirez l’eau supplémentaire avec une serviette en papier.
Pour l’analyse microscopique, utilisez un microscope équipé d’une caméra à bonne résolution. Analysez les diapositives à partir d’une extrémité. Capturez chaque champ microscopique.
Utilisez un grossissement de 10 ou 40x pour les racines épaisses et 40x pour les racines minces. Après la capture, renommez chaque image avec un code qui permettra le post-assemblage réel des parties racines. Utilisez un logiciel de présentation pour concevoir une planche à dessin pour l’assemblage d’images, définissez la largeur deux à trois centimètres plus large que la largeur de l’image.
Après avoir capturé 15 images, ajoutez toutes les images capturées d’un segment dans l’ordre de leur capture, en commençant par un à 15, et reconstruisez toute la longueur du segment racine. Ensuite, utilisez l’alignement vertical pour aligner les images au centre et assurez-vous que chaque image suit la précédente. Placez une grille de 10 par 150 cellules sur toutes les images pour couvrir tout le segment racine.
De plus, placez une grille de 10 par 10 sur chaque image et dans chaque cellule de cette grille, insérez un nombre de un à six si une structure mycorhizienne arbusculaire ou AM est visible, ou laissez vide si aucune structure AM n’est présente. Ajoutez un tableau pour une grille de 10 cellules de largeur et de 150 cellules de longueur. Modifiez le tableau avec les dimensions en fonction de la largeur des images, puis modifiez la longueur du tableau pour qu’il comprenne toutes les images.
Pour noter la colonisation mycorhizienne, utilisez le nombre unique pour noter chaque type de structure comme décrit dans la méthode du modèle mycorhizien. Utilisez un pour les hyphes, deux pour les arbuscules, trois pour les vésicules, quatre pour les spores, cinq pour les cellules auxiliaires et six pour les points d’entrée. Noter chaque structure mycorhizienne observée à partir de chaque cellule des grilles précédemment appliquées.
Après la notation, insérez tous les scores obtenus dans la feuille de calcul MycoPatt. Utilisez la fonction copier-coller pour transférer toutes les partitions de la présentation dans la première feuille nommée Données brutes. Pour l’analyse primaire, utilisez la troisième feuille nommée Paramètres pour visualiser les résultats sous forme de pourcentages séparément sous trois formes.
Utilisez les colonnes A à K pour analyser l’image horizontale de la colonisation, les colonnes M à W pour l’image verticale de la colonisation, et les colonnes Y à AI pour analyser la colonisation transversale pour chacun des 15 carrés de 10 par 10 et la colonisation moyenne finale. Ensuite, appliquez les définitions et les formules spécifiques à chaque paramètre. Pour la production et l’extraction de cartes mycorhiziennes, visualisez l’image obtenue à partir de la conversion du code des structures mycorhiziennes en couleurs dans la deuxième feuille nommée Graphiques.
Exportez ensuite l’image résultante dans la feuille graphique en tant qu’image et utilisez le code couleur dans la légende pour analyser les motifs mycorhiziens. Pour l’analyse cartographique mycorhizienne, identifiez les structures les plus importantes et leur assemblage. Décrivez ensuite le modèle de colonisation mycorhizienne observé dans les racines analysées, suivi d’une stratégie de colonisation basée sur le développement structurel observé dans la racine, le motif ramifié et le développement des vésicules arbusculaires.
Ce protocole fournit les détails des structures mycorhiziennes avec un bon contraste entre les structures mycorhiziennes et les cellules racinaires pour Zea mays et Festal rubra. Les procédures infructueuses de nettoyage et de coloration ont donné lieu à des images microscopiques peu claires des structures mycorhiziennes chez Festal rubra et Zea mays. Les modèles de colonisation mycorhizienne ont permis une exploration complète du mécanisme de colonisation, cette méthode fournit une exploration profonde et à petite échelle des modèles et des stratégies de colonisation pour Zea mays et Festuca rubra avec une expression visuelle supplémentaire des paramètres de colonisation.
Chez Zea mays, un potentiel de colonisation très fluctuant en fonction du stade de développement de la plante a été observé, cependant, chez Festuca rubra, les processus de colonisation se produisent à l’intérieur des racines et le développement de réseaux hyphes a été corrélé à une faible vitesse de développement des racines. MycoPatt convient à la cartographie de la colonisation mycorhizienne arbusculaire dans n’importe quelle plante. Il est également utile d’explorer pleinement le mécanisme de colonisation et d’évaluer la stratégie fongique le long des racines.
