Notre protocole fournit un pipeline pour une intégration précise et une détection visuelle simple des modifications CRISPR, ainsi qu’un exemple de phénotypage post-édition. Le principal avantage de cette approche est la facilité de détection des modifications CRISPR, permettant une identification efficace et simplifiée des modifications réussies. Cette approche permet de générer et de caractériser simplement des variantes associées à la maladie chez le poisson zèbre.
Ici, nous examinons le syndrome du QT long. Des études de suivi sur les thérapies pharmaceutiques sont alors réalisables à explorer. Commencez par concevoir deux guides d’ARNg pour exciser la séquence du site cible en identifiant l’orthologue du poisson zèbre pour le gène d’intérêt.
Utilisez Ensembl pour localiser le site cible dans la séquence génétique d’intérêt, y compris la séquence flanquante de deux kilobases utilisée pour fabriquer le modèle. Utilisez un logiciel de conception tel que CRISPOR et sélectionnez les espèces de Danio rerio et l’enzyme Cas. Pour l’approche à deux sgRNA, choisissez un sgRNA avant l’exon cible et un second sgRNA dans l’intron immédiatement en aval.
Assurez-vous que les sgRNA sélectionnés ont une spécificité élevée et une faible liaison hors cible prévue. Utilisez les classements CRISPOR pour identifier les guides avec une liaison hors cible minimale. Identifiez maintenant les sites hors cible potentiels les plus probables pour le génotypage de séquençage de Sanger basé sur la PCR.
Après avoir sélectionné les deux sgRNA, obtenir le complément inverse pour chacun, deux oligos complémentaires qui précèdent la mutation et deux oligos complémentaires en aval de la mutation. Ajouter des sites de restriction compatibles sur chaque oligo pour incorporer le guide dans le plasmide de votre choix. Pour l’intégration des séquences guides sélectionnées dans le plasmide DR274, créez un porte-à-faux à l’aide d’un site de restriction BSA1 à cinq nombres premiers et concevez les sites de reconnaissance BSA1 aux cinq extrémités principales des guides.
Ensuite, concevez le modèle exogène pour le HDR chez le poisson zèbre en choisissant deux fragments de séquence qui flanqueront le gène rapporteur YFP veineux M logé dans le plasmide PKHR5. Divisez le modèle en deux segments pour l’insérer de chaque côté du gène rapporteur YFP veineux M. Assurez-vous que le site divisé est dans un intron pour éviter de couper la séquence de codage.
Incorporer toutes les modifications requises mentionnées dans le manuscrit pour faciliter le clonage dans le plasmide PKHR5. Injecter les embryons au stade unicellulaire environ 40 minutes après la fécondation. Après trois jours de fécondation, anesthésiez la larve de poisson zèbre en la transférant dans une boîte de Petri de 25 millimètres contenant 0,3% MS222 jusqu’à ce qu’elle perde son réflexe d’auto-redressement.
Une fois anesthésiée, transférer la larve dans le puits d’une plaque de 24 puits. À l’aide d’un microscope capable de détecter la GFP ou la YFP, dépister la fluorescence du gène rapporteur dans les yeux de la larve. Après avoir capturé les images de la larve, documenter la présence ou l’absence de l’expression du gène rapporteur.
Pour confirmer l’exactitude et la précision de l’édition du gène HDR, effectuer le génotypage en anesthésiant d’abord la larve trois jours après la fécondation, comme démontré précédemment, et en isolant l’ADN génomique du clip de queue à l’aide de la méthode du hotshot. Ajouter le clip de queue excisé à 15 microlitres d’hydroxyde de sodium 25 millimolaires et l’incuber à 95 degrés Celsius pendant 20 minutes, puis neutraliser avec 1,5 microlitre d’acide chlorhydrique tris. Centrifuger à 13 800 fois G pendant 30 secondes et conserver le surnageant contenant l’ADN génomique extrait.
Récupérer la larve dans un milieu E3 et la remettre dans le système de logement si une étude plus approfondie est prévue. En utilisant l’ADN génomique extrait comme modèle, effectuez un séquençage de Sanger basé sur la PCR des sites cibles et potentiels hors cible. Assurez-vous que la conception de l’amorce sur la cible capture le site de mutation et le site de liaison de l’ARNg le plus proche.
Concevoir une amorce de séquençage distincte pour détecter la transition entre le bras d’homologie inséré et le gène cible afin de confirmer l’intégration dans le gène d’intérêt. Concevez des amorces pour séquencer les trois principaux sites potentiels hors cible. Compiler sur et hors cible le génotypage, la fréquence cardiaque, les dimensions péricardiques, le phénotypage ECG et les données génétiques rapporteures identifiables pour chaque poisson zèbre.
L’expression du gène rapporteur veineux YFP M a été observée dans les îles, agissant comme un rapporteur positif de l’intégration réussie du modèle. Les poissons porteurs du gène rapporteur se sont avérés avoir l’édition précise G2A qui introduit la variante R56Q dans ZKCNH6A. La mesure des dimensions péricardiques en tant que rapport du contour des yeux est présentée ici.
Une tendance de bradycardie avec augmentation de l’œdème péricardique associé aux troubles de la repolarisation cardiaque chez les poissons-zèbres a été observée chez les larves modifiées par le gène R56Q. L’enregistrement ECG d’un cœur de larve de poisson zèbre trois jours après la fécondation est montré ici. L’aspect le plus important de cette approche est la conception de guides, comme c’est souvent le cas dans les procédures CRISPR.
Des guides efficaces sont essentiels pour des modifications CRISPR réussies. Des méthodes CRISPR alternatives peuvent être suivies, ce qui permet une plus grande précision ou d’autres fonctionnalités. De plus, de grands gènes peuvent être insérés, tels qu’un complexe d’édition principal fournissant un système d’édition inductible in vivo.
