Les auteurs tiennent à remercier les Freimann Life Science Center et le Centre pour le personnel de recherche Zebrafish pour leurs soins et l&#39;entretien du poisson zèbre.

1. Préparation de morpholino: <ol><li> Tous les oligos morpholino devrait être conçu sur mesure et commandés par l&#39;intermédiaire GeneTools (Philomath, OR). Nous utilisons les chargés positivement lissamine-tagged morpholinos pour conduire le morpholinos électroporées vers l&#39;électrode négative. Nous avons essayé, en vain, de cibler chargés négativement marqués à la fluorescéine morpholinos à l&#39;électrode positive en utilisant cette technique. Diluer 300 nmol de morpholino en 100 pl d&#39;eau sans nucléase pour obtenir une solution 3 mM. Aliquoter le morpholino en plusieurs microtubes paraffine scellés. Stocker à l&#39;écart de la lumière à température ambiante. </li><li> Déterminer la concentration morpholino en diluant 5 ul de morpholino (ou de l&#39;eau utilisée pour diluer le morpholino comme une vierge) dans 95 ul de 0,1 N HCl. Régler la longueur d&#39;onde du spectrophotomètre (λ) à 265 nm. Calculer la constante de votre morpholino utilisant l&#39;équation suivante: Constante = poids moléculaire particulière à votre morpholino X absorbance 1000/molar. </li><li> Vous trouverez le poids moléculaire et les données d&#39;absorbance molaire sur les &quot;Propriétés Oligo« feuille fournie avec chaque morpholino. Analyser le blanc afin de vérifier les lectures de base et de prendre des lectures de chaque dilution morpholino. Multipliez l&#39;absorption à 265 nm de chaque morpholino par sa constante déterminée et par le facteur de dilution pour obtenir la concentration en ng / ul. Divisez ce chiffre par le poids moléculaire pour déterminer la concentration en mM. Diluer le morpholino, si nécessaire, à une concentration de travail. </li></ol> 2. Retirez la couche extérieure de cornée: <ol><li> Anesthetize mois 6-12 adulte poisson zèbre vieux tricaïne ou 2-phénoxyéthanol à 1,0 mg / ml dans l&#39;eau du réservoir du poisson zèbre. </li><li> Enveloppez le poisson zèbre dans un morceau de serviette humidifiée papier, couvrant les branchies, mais en laissant l&#39;œil exposé. Le poisson enveloppé est placé sous un stéréoscope et le grossissement est augmentée jusqu&#39;à ce que le diamètre de l&#39;œil se remplit d&#39;environ un tiers desle champ visuel (figure 1). </li><li> Utiliser Dumont # 5 pinces, attrapez la cornée extérieure près de la fissure optique. Ce tissu est coloré en rouge et est étiqueté «OC» dans la figure 1. Il ya une légère saillie ou la lèvre indiqué par la flèche étiquetée «CL». Tirez à un angle faible (10 degrés) à travers l&#39;œil pour enlever la cornée externe. Avec la pratique, cela peut être complété en un seul mouvement. Si le bordereau de pinces à épiler, re-saisir les tissus et tirez à nouveau à un angle faible jusqu&#39;à leur suppression. Une cornée bien attachés peuvent causer l&#39;œil pour être délogé de la prise lorsqu&#39;il est tiré. Vous pouvez garder l&#39;œil de devenir délogé par stabilisation avec un autre jeu de pinces à épiler. </li></ol> 3. Incision de la cornée et l&#39;injection de morpholino: <ol><li> Immédiatement après l&#39;enlèvement de la cornée externe, faire une petite incision dans la cornée, où l&#39;élève satisfait aux iris (figure 2). Ceci est fait en utilisant une lame de bistouri saphir (voir Matériel). </li><li> Charge 0,5 pl de la solution 3,0 mM dans un morpholino Hamiltsur la seringue équipée d&#39;une jauge de 33 amovible, à bout émoussé l&#39;aiguille (voir Matériel). Pipeter haut et bas pour éliminer les bulles d&#39;air dans la ligne. Insérez soigneusement l&#39;aiguille dans le corps vitré dans l&#39;incision (figure 2). Ne pas insérer l&#39;aiguille trop loin ou vous percer la rétine ou le déplacement de la lentille. </li><li> Injecter lentement la solution morpholino dans l&#39;espace vitré. Selon l&#39;âge des poissons, l&#39;espace vitré tiendra ~ 0,5 pi. Vous devriez visualiser vitreuse incolore qui fuit hors de l&#39;incision comme il est déplacé par la solution morpholino. Injecter jusqu&#39;à ce qu&#39;une petite quantité de solution de fuites morpholino hors de l&#39;incision. Vous devriez visualiser clairement les lissamine-tagged morpholino intérieur de l&#39;œil. </li><li> Après l&#39;injection, le retour des poissons dans le réservoir pour récupérer. Nous habituellement seulement d&#39;injecter de l&#39;œil gauche, en utilisant l&#39;œil droit comme un contrôle non-injecté, mais l&#39;électroporation des deux yeux est possible. </li></ol> 4. L&#39;électroporation: <ol><li> Suitel&#39;injection d&#39;environ 10 poissons, re-anesthésier un poisson injecté et l&#39;envelopper dans un morceau de serviette en papier humide, couvrant juste les branchies, mais en laissant l&#39;œil exposé. Transférer le poisson à une boîte de Pétri. Mettez des gants en latex ou similaire afin d&#39;éviter l&#39;exposition à l&#39;anesthésie. Tout doucement tenant le poisson au fond du plat, remplir la cuve avec l&#39;anesthésie (figure 3, panneau de gauche). </li><li> Une électrode de 3 mm de diamètre en platine plaque (voir Matériel) localise les impulsions d&#39;électroporation à environ la moitié de la rétine. Nous visent généralement la rétine dorsale. Appuyez doucement sur l&#39;électrode positive à la baisse sur la moitié ventrale de l&#39;œil. Avec l&#39;externe de la cornée retirée, l&#39;oeil est facilement tourné, exposant la partie dorsale du globe oculaire. </li><li> Alors qu&#39;il était encore en appuyant sur la face ventrale de l&#39;œil, placer l&#39;électrode négative à proximité de (~ 1 - 2 mm) la moitié exposée dorsale de l&#39;œil. Soyez prudent de ne pas toucher l&#39;électrode négative directement à l&#39;œil, qui se traduira par endommagerla rétine dorsale. Une fois que vous déterminer la distance appropriée entre les électrodes, utiliser la vis de réglage sur la poignée des électrodes pour maintenir cette diffusion lors électroporation. Cela maintient l&#39;électrode négative une distance optimale de l&#39;oeil lorsque l&#39;électrode positive est enfoncé en position. </li><li> Électroporation l&#39;œil en utilisant un Electroporateur CUY21 Square Wave (voir Matériel). Les paramètres d&#39;électroporation doit être réglé sur deux années consécutives de 50 ms impulsions, à 75 V avec une pause de 1 seconde entre les impulsions. </li><li> Retour du poisson dans le réservoir. En général, nous commençons notre protocole pour constante induite par la lumière la dégénérescence rétinienne, immédiatement après l&#39;électroporation. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: <ol><li> Pour 3-5 jours après l&#39;électroporation (en fonction de la stabilité de la morpholino), l&#39;étiquette lissamine peuvent être visualisées dans toutes les couches de la rétine dans une rétine sectionnés (figure 4). Cela sert comme une confirmation de la présence del&#39;étiquette morpholino. </li><li> Nous pouvons atteindre knockdown protéine complète jusqu&#39;à 3-5 jours après l&#39;électroporation, en fonction de l&#39;efficacité de la morpholino (figure 5). Typiquement, au cours d&#39;études traitement par la lumière, nous récoltons les yeux à 3 ou 4 jours après l&#39;électroporation morpholino. Ceci est fait en enlevant l&#39;œil entier avec une pince Dumont 5B # avec des extrémités incurvées (figure 6; Matériaux) et le traitement des tissus pour l&#39;immunohistochimie 15. Comme avec n&#39;importe quelle technique knockdown, une démonstration de knockdown efficaces doivent être indiqués afin de valider le phénotype. Par conséquent, nous vous suggérons d&#39;obtenir des antisérums pour votre protéine d&#39;intérêt. Alternativement, si et les anticorps ne sont pas disponibles et le morpholino est dirigée soit à la accepteur d&#39;épissage ou le site des donateurs dans le pré-ARNm, il va bloquer l&#39;épissage de l&#39;ARNm de l&#39;efficacité. Dans ce cas, il est possible d&#39;utiliser de la transcriptase inverse-PCR pour amplifier les séquences flanquantes dans l&#39;ARN morphant et de déterminer l&#39;efficacité du blocage des splic normalemotif de ING. </li><li> Lorsque les rétines sont sectionnés à partir nasale temporelles sur l&#39;axe dorsal ventral, les cases en bleu (figure 6) représentent les zones de la rétine qui sont le plus souvent endommagés par l&#39;événement lui-même l&#39;électroporation. La case grisée rose représente la zone qui est ciblé pour l&#39;introduction dans les cellules rétiniennes morpholino par l&#39;électroporation. </li></ol><img alt="Figure 1." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma illustrant le retrait des couches épithéliales de la cornée. Le panneau de gauche montre les principales caractéristiques structurelles de l&#39;œil, y compris la lentille (L), le corps vitré (Vit), de la rétine (R), l&#39;externe de la cornée (OC), la cornée interne (IC), et la protubérance cornée ( CL). L&#39;orientation de l&#39;oeil est montré dans le coin inférieur droit du premier panneau et est étiqueté antérieure (A), postérieur (P), dorsale (D) et ventrale (V). La coloration rouge indique l&#39;externe de la cornée qui est retiré. Le bac secondes<html> el montre comment la pince sont utilisées pour saisir la saillie de la cornée et de tirer la cornée externe à travers l&#39;œil à un angle faible (troisième groupe). Le panneau de droite montre comment une deuxième paire de pince peut être utilisée pour stabiliser l&#39;œil tout en tirant la cornée. <img alt="Figure 2." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig2.jpg" /> Figure 2. Schéma des étapes impliquées dans l&#39;injection intravitréenne de morpholino. Une petite incision est faite dans l&#39;œil, où l&#39;élève satisfait aux iris (panneau de gauche). L&#39;écart résultant devrait être juste assez grand pour une aiguille de calibre 33, qui est rempli avec la solution morpholino, à insérer (panneau du milieu). Injecter lentement 0,5 ul de la solution dans le corps vitré (à droite). Vous devriez visualiser une petite quantité de solution vitréenne de sortir de l&#39;incision que le vitré est partiellement remplacé par des lissamine-tagged morpholino (panneau de droite). ig3.jpg &quot;/&gt; Figure 3. Schéma de la procédure d&#39;électroporation général. Les poissons anesthésiés, ce qui a été injecté par voie intravitréenne avec le morpholino, est doucement enveloppé dans une serviette en papier humide (panneau de gauche). La serviette en papier devrait couvrir les branchies, mais pas obstruer l&#39;oeil (panneau du milieu). Appuyez doucement sur l&#39;électrode positive vers le bas sur la partie ventrale de l&#39;œil, permettant à la moitié dorsale de l&#39;œil pour faire tourner hors de la douille. Placer l&#39;électrode négative d&#39;environ 1 mm de la moitié dorsale de l&#39;œil et de commencer l&#39;électroporation (panneau de droite). <img alt="Figure 4." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig4.jpg" /> Figure 4. Image confocale comparant une rétine électroporées sans intravitréenne injecter un morpholino lissamine-marqués (A), et une rétine par voie intravitréenne injecté et l&#39;électroporation avec morpholino lissamine-marqués (B). L&#39;étiquette lissamine se retrouve dans toutes les couches de la rétine et des types de cellules. ROS, tige extérieuresegments; ONL, couche nucléaire externe; INL, couche nucléaire interne; GCL, couche des cellules ganglionnaires. <img alt="Figure 5." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig5.jpg" /> Figure 5. Confocale images comparant immunolocalisation PCNA dans les rétines électroporation avec un morpholino témoin (à gauche) et rétines électroporation avec une morpholino anti-PCNA (panneaux de droite) avant induite par la lumière la mort cellulaire des photorécepteurs. Adaptés à l&#39;obscurité de poisson zèbre adulte albinos ont été placés dans une lumière intense constante pour 1, 2 ou 3 jours après l&#39;électroporation du morpholino. Le morpholino de contrôle ont échoué à réprimer l&#39;expression de PCNA croissante dans les rétines endommagées-lumière. Le morpholino anti-PCNA efficacement renversé l&#39;expression des protéines PCNA travers trois jours de dégâts de lumière constante intense. <img alt="Figure 6." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig6.jpg" /> Schéma Figure 6. (Panneau de gauche) montrant l&#39;énucléation de l&#39;œil pour processing et cryosectioning, qui se fait le long de l&#39;axe dorsal ventral. La boîte rose ombragé (panneau de droite) montre la région de la rétine avec la plus grande quantité de protéines knockdown utilisant cette technique. Les cases bleues ombrées représentent les zones qui sont le plus souvent endommagés par l&#39;événement électroporation. L&#39;orientation de l&#39;oeil est étiqueté antérieure (A), postérieur (P), dorsale (D) et ventrale (V).

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Nous n&#39;avons rien à divulguer

Récemment, deux analyses microarray a examiné les changements d&#39;expression génétique qui s&#39;est produite lors de la régénération de la rétine soit endommagée lumière ou un patch excisés chirurgicalement-rétinien 10, 16. Les deux études ont révélé de nombreux gènes qui présentaient d&#39;importants changements dans l&#39;expression, soit en augmentant ou en diminuant, que vraisemblablement sont nécessaires pour les différents événements qui se produisent lors de la régénération de la rétine, comme la rentrée de la glie Müller dans le cycle cellulaire, la prolifération et la migration continue de la progéniteurs neuronaux à la couche endommagée de la rétine, et la différenciation des progéniteurs neuronaux dans le type de cellules neuronales correcte. Bien qu&#39;une comparaison directe de ces données de biopuces deux ensembles révèlent les gènes candidats qui pourraient être impliqués dans ces événements cellulaires, finalement ces gènes et leurs protéines codées doivent être testés afin de déterminer si elles sont nécessaires pour la régénération neuronale. Ici, nous décrivons un puissant de perte de fonction d&#39;approche aux conditioprotéines knockdown Nally d&#39;intérêt dans la rétine de poisson zèbre adulte. Cette technique a été utilisée pour étudier les protéines extracellulaires et intracellulaires, ainsi que des molécules de signalisation, des facteurs de transcription et des protéines nécessaires à 17-19 réplication de l&#39;ADN. Ainsi, cette méthode a grandement facilité notre compréhension du mécanisme moléculaire qui sous-tendent les adultes de régénération de la rétine chez le poisson zèbre. Nous avons testé plusieurs paramètres d&#39;électroporation (tension, le nombre d&#39;impulsions, le temps entre les impulsions) avant un protocole a été réalisé avec succès. Un précédent rapport de l&#39;électroporation morpholinos dans la nageoire caudale de poisson zèbre régénérant utilisé 10 impulsions à basse tension (15 V) 20. Parce que la rétine de poisson zèbre adulte est entouré par des couches cellulaires multiples et ne sont pas facilement accessibles aux électrodes pince à épiler, les paramètres utilisés dans la nageoire ont échoué à l&#39;électroporation efficace morpholinos dans la rétine adulte. Inversement, une haute tension (100 V), souvent resulted dans la mort des poissons. Récemment, 5 impulsions de 80 V a été décrit pour électroporer ADN plasmidique dans la rétine de souris nouveau-nés chiot 21. Nous avons constaté qu&#39;un peu moins deux impulsions intenses de 75 V abouti à l&#39;électroporation réussie de la morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte avec la survie de 100% des poissons traités. De plus, nous avons découvert que la suppression de la plupart des extérieurs (ou externe le plus) composante de la cornée grandement augmenté l&#39;efficacité d&#39;électroporation. Accroître le nombre d&#39;impulsions peut éliminer le besoin pour l&#39;enlèvement de ce tissu, mais peut aussi causer des dommages plus les tissus. Des études ont démontré un contrôle étendu que ces paramètres n&#39;a pas causé la mort des cellules rétiniennes importantes ou de modifier les réponses cellulaires spécifiques observés pendant la régénération photorécepteur 19. Gain de fonction des études sont actuellement pas possible en utilisant cette technique in vivo, en raison de notre incapacité à constamment électroporation grandes acides ribonucléiques dans tous les rcellules etinal. Cependant, le succès de électroporation des plasmides dans la rétine de souris in vivo et de la rétine de poisson zèbre dans des explants de penser qu&#39;il ya encore une possibilité chez le poisson zèbre 21, 22. Un des points forts de cette technique est l&#39;électroporation semble efficace introduire le morpholino dans tous les différents types de cellules rétiniennes. Cependant, une faiblesse potentielle, c&#39;est que l&#39;électroporation efficace livré le morpholino en seulement les régions dorsale et centrale de la rétine. Un événement électroporation seconde vers la moitié ventrale de la rétine dans les résultats un bon ciblage de toutes les couches, mais entraîne souvent des dommages. Cette restriction spatiale était probablement due à la forme et le placement des électrodes. L&#39;utilisation d&#39;électrodes de tasse conçu sur mesure en forme qui pourraient être placés autour de l&#39;œil peut améliorer cette faiblesse. Cette restriction spatiale de la livraison morpholino limite l&#39;utilisation de cette technique et exclut l&#39;utilisation d&#39;un dosage de succèsh que l&#39;analyse de l&#39;ERG qui exigerait une évaluation globale de la rétine. Il est à noter que, comme avec n&#39;importe quelle expérience morpholino, il est conseillé de confirmer vos résultats en utilisant un second, sans chevauchement morpholino à l&#39;ARNm cible. Dans certains cas, il est possible aussi d&#39;électroporation deux morpholinos différents simultanément à knockdown l&#39;expression de deux protéines différentes. Nous avons démontré cela en renversant l&#39;expression à la fois des protéines et des Pax6a Pax6b, individuellement et en combinaison 18. Bien que nous avons démontré l&#39;utilisation de cette technique avec notre modèle de légers dommages, il pourrait probablement être utilisé pour étudier la régénération dans les modèles ou les autres dommages 2-8 utilisée pour examiner la fonction des protéines dans la rétine intacte. Par exemple, l&#39;électroporation de morpholinos pourrait être utilisé pour knockdown l&#39;expression des canaux ou de molécules spécifiques de transduction du signal dans le ganglion ou les cellules amacrines et ensuite étudier la fonction de ces signauxvoies dans le traitement visuel. Cependant, comme morpholinos affectent uniquement la traduction des protéines nouvelles, on aurait pu attendre le renouvellement des protéines endogènes se produit avant un test pourrait être effectué. Selon la stabilité de la protéine, qui pourrait varier de 18 heures à plusieurs jours.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT ou CUY21-SC onde carrée électroporateur </td><td> Protech international </td><td> CUY21EDIT ou CUY21SC </td><td> Les deux unités de travail pour ce protocole </td></tr><tr><td> De 3 mm de diamètre électrodes à aubes </td><td> Protech international </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morpholino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morpholino devrait être conçu sur mesure pour votre protéine d&#39;intérêt </td></tr><tr><td> 2-phénoxyéthanol </td><td> Sigma </td><td> 77861-1L </td><td> Anesthésie; diluer dans de l&#39;eau 1:1000 système de poissons pour la procédure, 1:500 pour l&#39;euthanasie </td></tr><tr><td> Dumont # 5 pinces </td><td> Instruments de précision du monde </td><td>14095 </td><td> Tout # 5 pincettes avec le travail </td></tr><tr><td> Pincette Dumont # 5B avec des conseils en angle </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 500234 </td><td> Utilisé pour l&#39;euthanasie suivants énucléer les yeux </td></tr><tr><td> Sapphire lame, à double pointe lance, 1 mm de large, avec un manche de couteau Sapphire </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> Blade: 500314 Poignée: 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton seringue avec manomètre amovible 33 aiguilles à bout émoussé </td><td> Société de Hamilton </td><td> Seringue: 87930 Aiguille: 7762-06 </td><td> Retirez l&#39;aiguille qui vient avec une seringue et la remplacer par de calibre 33 à bout émoussé l&#39;aiguille </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina

Beaucoup dévastatrices maladies oculaires héréditaires conduire à la cécité progressive et irréversible parce que les humains ne peuvent se régénérer mourants ou malades neurones rétiniens. En revanche, la rétine de poisson zèbre adulte possède la capacité robuste pour régénérer spontanément toute catégorie de neurones qui se perd dans une variété de différents modèles de lésions de la rétine, y compris la ponction de la rétine, l&#39;ablation chimique, concentrées à haute température, et traitement par la lumière intense 1-8. Notre laboratoire largement caractérisé la régénération des photorécepteurs après un traitement intense de lumière constante et intérieure neurones rétiniens après l&#39;injection intravitréenne ouabaïne 2, 5, 9. Dans tous les cas, un résident gliales Müller réintégrer le cycle cellulaire pour produire des progéniteurs neuronaux, qui continuent à proliférer et à migrer vers la couche appropriée de la rétine, où ils se différencient en neurones déficients. Nous avons caractérisé cinq étapes différentes au cours de la régénération de la lumière-damarétine GED qui ont été mises en évidence par les réponses spécifiques cellulaires. Nous avons identifié plusieurs gènes différentiellement exprimés à chaque étape de la régénération de la rétine par l&#39;analyse des microréseaux d&#39;ARNm 10. Beaucoup de ces gènes sont également essentiels pour le développement oculaire. Pour tester le rôle de chaque gène candidat / protéine pendant la régénération de la rétine, nous avions besoin pour développer une méthode pour conditionnellement limiter l&#39;expression d&#39;une protéine unique candidat à la fois pendant la régénération de la rétine adulte. Oligos morpholino sont largement utilisées pour étudier la perte de fonction des protéines spécifiques lors du développement du poisson zèbre, xénope, poulet, la souris et des tumeurs dans les xénogreffes humaines 11-14. Ces paires de bases modifiées oligos avec l&#39;ARN de séquence complémentaire à bloquer l&#39;épissage ou la traduction de l&#39;ARN cible. Morpholinos sont stables dans la cellule et peut éliminer ou l&#39;expression des protéines &quot;knockdown&quot; pendant trois à cinq jours 12. Ici,Nous décrivons une méthode de manière efficace l&#39;expression des protéines cibles knockdown dans la rétine de poisson zèbre adulte. Cette méthode emploie lissamine-tagged morpholinos antisens qui sont injectés dans le corps vitré de l&#39;œil de poisson zèbre adulte. En utilisant une pince électrode, le morpholino est alors électroporés dans tous les types cellulaires de la rétine dorsale et centrale. Lissamine fournit la charge sur le morpholino pour l&#39;électroporation et peuvent être visualisées à évaluer la présence de la morpholino dans les cellules de la rétine. Knockdown conditionnelle dans la rétine peut être utilisé pour examiner le rôle des protéines spécifiques à différents moments pendant la régénération. De plus, cette approche peut être utilisée pour étudier le rôle des protéines spécifiques de la rétine intacte, dans les processus tels que la transduction visuelle et le traitement visuel dans les neurones de second ordre.

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In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Une méthode pour l&#39;expression conditionnelle knockdown une protéine cible dans la rétine de poisson zèbre adulte est décrite, qui consiste à injecter par voie intravitréenne morpholinos antisens et les électroporation dans la rétine. La protéine résultante est assommée pendant plusieurs jours, ce qui permet de tester le rôle de la protéine dans la régénération ou de la rétine intacte.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

19.1K vues.  Wayne State University School of Medicine. Une méthode pour l'expression conditionnelle knockdown une protéine cible dans la rétine de poisson zèbre adulte est décrite, qui consiste à injecter par voie intravitréenne morpholinos antisens et les électroporation dans la rétine. La protéine résultante est assommée pendant plusieurs jours, ce qui permet de tester le rôle de la protéine dans la régénération ou de la rétine intacte.

Vidéo: In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with imaging techniques, genetic manipulation, and electrophysiological recording. Here we present a simple interphase tissue culture system for adult rabbit retina that requires no specialized equipment and very little maintenance. We demonstrate the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells. Rabbit retinas cultured this way can be kept alive for up to 6 days with very little changes of the overall anatomical structure or the morphology of individual ganglion- and amacrine cells.

This article demonstrates the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells.

Culture organotypique de Retina lapin adulte

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Recherche

Biologie

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

L&#39;électroporation cellule unique in vivo dans le cerveau intact développement

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Rétro-orbitaire d&#39;injection chez le poisson zèbre pour adultes

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection d&#39;organes sur le poisson zèbre pour adultes

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Injection intrapéritonéale en Zebrafish adultes

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Livraison directe de morpholinos MIF Into the otocyste Zebrafish par injection et électroporation affecte le développement oreille interne

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

La transplantation de cellules directement dans le rein de poisson zèbre adulte

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissection du rein Zebrafish adultes

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la régénération des adultes Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

En électroporation Ovo dans la rétine de poussin embryonnaire

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...