Les auteurs reconnaissent la Fondation Leducq (MITRALE) et l&#39;Agence Nationale pour la Recherche (ANR Specistem) pour financer cette recherche.

1. Préparation procédures animales Obtenir l&#39;approbation d&#39;un comité d&#39;éthique animale et suivre les directives institutionnelles pour le travail avec le virus, HuESC et / ou iPSC (le cas échéant) la manipulation de la souris, ainsi que, l&#39;obtention d&#39;embryons de souris, et effectuer une chirurgie de la souris. Pour les accouplements heures, le jour de la fiche est considéré comme le jour embryonnaire (E) 0,5 / 0,5 jours post-coït. <ol><li> les aiguilles de microinjection: Ex utero microinjection, tirer des pipettes en verre (tubes diamètre borosilicate capillaires externes 1,2 mm) à l&#39;aide d&#39;un extracteur de pipette / biseauteur pour obtenir une um de diamètre de pointe interne 1 ou 10 et une forme pointue et conique pointe à injecter de l&#39;ADN ou des cellules, respectivement. Pour les injections d&#39;échographie médiation, l&#39;utilisation adaptée des aiguilles stériles, ayant un diamètre extérieur / intérieur (OD / ID) de 1,14 mm mm/0.53, avec une pointe 50/35 um OD / ID. </li><li> Des boîtes de Petri remplies de silicium: Préparer le silicium, comme décrit dans le manuel. Remplirune boîte de Petri d&#39;un diamètre de verre propre de 60 mm avec une couche d&#39;élastomère d&#39;environ 1 cm. Éviter les bulles d&#39;air. </li><li> Instruments: Gardez tous les instruments chirurgicaux stériles avant et pendant la procédure. </li><li> préparation d&#39;ADN: Ajouter 3 pg d&#39;ADN et 12 pi Opti-MEM dans un tube. Ajouter 3 pi Lipofectamine 2000 et 12 pi Opti-MEM dans un autre tube. Incuber pendant 5 min à température ambiante et mélanger les deux solutions. Utiliser immédiatement. </li><li> Préparation des cellules: Préparer une suspension de 10 6 cellules / ml de DMEM (milieu de Eagle de Dulbecco, haute teneur en glucose et du sérum de rat à 50%). 50 ul de la suspension cellulaire finale est suffisant pour 8 à 10 embryons. </li><li> Teindre préparation: Utilisez le fluorescente verte CDCFDA-SE à 25 mg / ml de DMSO. Préparer 20 aliquotes et conserver à -20 ° C. Diluer 1:100 / 1:200 dans une solution saline stérile ou STP avant l&#39;utilisation. </li><li> préparation de virus: Utilisez une PGK-GFP exprimant lentivirus 3 e génération commercial avec un titre de 10 ~ 9 -10 10 transducing unités / ml de DMEM. Pour la préparation des lentivirus, voir Tiscornia et al. 14 Porter un équipement de protection individuelle et utiliser en toute sécurité et éliminer le virus. </li></ol> 2. Collection de E9.5 et E10.5 embryons pour Ex vivo Injection <ol><li> Euthanasier une souris enceinte au jour embryonnaire 9.5 ou 10.5. </li><li> Stériliser la poitrine et l&#39;abdomen de la souris avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Faire une incision médiane ventrale pour ouvrir l&#39;abdomen et récupérer la corne utérine à la température ambiante dans du PBS et le transférer après deux lavages PBS pour un plat de silicone remplie de Pétri avec un milieu M16. </li><li> Epingler la corne utérine avec des épingles insectes à la couche de silicone de sorte que le côté vascularisée de l&#39;utérus est en bas. </li><li> Couper la surface de l&#39;utérus avec une pince fine, et un plafond de la caduque à 1 mm en dessous de la surface. </li><li> Retirer délicatement l&#39;embryon dans le sac jaune en étalant les murs de la caduque. </li><li> Stocker les embryons à 37 °; C en milieu M16 avant l&#39;injection des cellules. Pour l&#39;injection, chaque embryon est transféré dans le moule en silicone remplie de milieu M16 pré-chauffé à 37 ° C. </li></ol> 3. L&#39;ADN cellulaire ou injection sous un stéréomicroscope <ol><li> Remplir la pipette de verre à l&#39;arrière avec une seringue Hamilton et secouer la pipette pour éliminer les bulles à la pointe. </li><li> Régler la pipette sur le support de la micro-injection; régler la pression de maintien à 50 (ADN) ou 30 (cellules) hPa, et la pression d&#39;injection de 150 (ADN) et 300 (cellules) hPa. Réglez l&#39;heure de l&#39;injection de 0,2 sec (ADN) ou 0,5 sec (cellules). Ces paramètres peuvent varier légèrement en fonction du type de micro-injecteur et la pipette. </li><li> Pin de l&#39;embryon vers le bas de silicone à travers le sac vitellin, sans toucher l&#39;embryon approprié. Regarder la région du cœur et ouvrir le sac juste au-dessus de cette région. </li><li> Ajouter 4 broches autour de l&#39;embryon pour empêcher tout mouvement pendant l&#39;injection des cellules. </li><li> Utilisation du micromanipulateur (mis à manuel), slowly la position de la pointe de la pipette à un angle de 45 ° au-dessus du péricarde, juste au-dessus de la région du coeur qui doit être injecté (figure 1). </li><li> Déplacer la pipette dans la région d&#39;intérêt et de déclencher l&#39;injection. Prenez la pipette aussi rapidement que possible. Assurez-vous que le coeur est bien battre après injection d&#39;ADN / cellule. </li></ol> 4. L&#39;embryon, le coeur isolé, et Explantation Culture <ol><li> Culture des embryons E9.5 à 25% de milieu M2 et du sérum de rat à 75%, supplémenté avec de la pénicilline / streptomycine, pré-chauffé à 37 ° C et oxygénée avec 40% d&#39;O 2. </li><li> Ajouter 2 ml de milieu de culture dans un tube en verre de 25 ml, ajouter doucement l&#39;embryon, et oxygéné avec 40% O 2 avant de visser le bouchon sur le tube. Incuber jusqu&#39;à 36 heures à 37 ° C tout en faisant tourner ou en agitant (30 tours / min). </li><li> Au point de temps désirée (par exemple 24 heures), disséquer le cœur avec soin pinces fines, sans toucher les cœurs, d&#39;abord decapitating les embryons; le cœur est facile à accise en le tirant à l&#39;aide de la voie d&#39;éjection distale. </li><li> Culture du coeur isolé pour un autre 36-48 heures dans du DMEM avec 50% de FCS sur un insert Matrigel revêtu mettre dans une plaque de 12 puits. Voir Dyer et Patterson (2013) pour un protocole amélioré de la culture du cœur 15. </li><li> Faire aucune explant de la région d&#39;intérêt. A titre d&#39;exemple, disséquer le canal auriculo-ventriculaire (AVC) et de la culture pendant 48 h sur le collagène de type 1 de 16 gel. </li></ol> 5. Injection guidée par échographie dans le coeur je n utero <ol><li> Configuration de la machine à ultrasons et micro-injecteur: <ol><li> Utilisez le système d&#39;échographie à haute résolution avec un transducteur de 40 MHz et installation de micro-injection sur un rail. </li><li> Réglez le volume d&#39;injection sur le micro-injecteur à 69 nl par injection. Consultez le manuel de micro-injection du fabricant pour la programmation du micro-injecteur. </li></ol></li><li> Préparation de la microiconfiguration njection et injection: <ol><li> Placer une micropipette de verre dans le micro-injecteur. Pour assurer l&#39;efficacité d&#39;injection, la première couche du côté intérieur de la pipette avec de l&#39;huile minérale par aspiration jusqu&#39;au volume maximum. Puis éjecter l&#39;huile à nouveau, laissant 1-2 mm d&#39;huile dans l&#39;aiguille. </li><li> Aspirer le produit à injecter jusqu&#39;à volume maximum est atteint. Veillez à ne pas toucher les surfaces avec la pointe de l&#39;aiguille car cela émousser la pointe et faire une injection plus difficile. </li><li> Pour stabiliser la corne utérine contenant les embryons lors de l&#39;injection, utiliser un plat modifié Petri avec un trou au milieu (2,5 cm de diamètre), recouverte d&#39;une membrane de silicone mince avec une petite fente découpée dans le centre, et le positionner au-dessus du site d&#39;incision . Stabiliser la boîte de Pétri sur la table de manipulation de la souris en plaçant 3-4 touffes d&#39;argile sous les bords de la coupelle. </li></ol></li><li> procédure d&#39;injection: <ol><li> Raser l&#39;abdomen d&#39;une souris enceinte (au stade embryonnaire désiré) avant anesthésiesie pour enlever les poils. Traiter l&#39;abdomen avec un agent de l&#39;épilation chimique pour enlever les poils résiduelle et stériliser à 70% d&#39;éthanol. </li><li> Anesthésier une souris enceinte avec de l&#39;oxygène / isoflurane via un masque facial. Utilisation 3-5% d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène à 100% pendant l&#39;anesthésie initiale, suivie par de 1 à 1,5% pendant le reste de la procédure. Assurez-vous que la souris est correctement anesthésié en pinçant doucement ses pattes et / ou la queue. </li><li> Placez le décubitus dorsal de la souris sur la table de manipulation de la souris (mis à chauffer à 37 ° C) et couvrir les yeux avec un lubrifiant pour éviter la déshydratation de la cornée. </li><li> Appliquer le gel d&#39;électrode sur les électrodes et collez les pattes aux électrodes pour surveiller le rythme cardiaque, le rythme respiratoire, et l&#39;ECG. Positionner un thermomètre rectal pour surveiller la température du corps. </li><li> Vérifiez d&#39;abord que la souris est enceinte en visualisant et en comptant les embryons par ultrasons. Appliquer un gel à ultrasons sur l&#39;abdomen et positionner la tête de balayage au-dessus de la vessie. Par souci de cohérence, de visualiser la vessie premier,et compter les embryons in gauche et droite cornes utérines, à partir de la position de la vessie. Veiller à ce que les cœurs embryonnaires battent normalement. </li><li> Si la souris est enceinte, placez la boîte de Pétri au-dessus du futur site de l&#39;incision avec de l&#39;argile. Appuyez sur le plat légèrement sur l&#39;abdomen ainsi que le plat est en contact direct. </li><li> Retirer le plat et stériliser à nouveau l&#39;abdomen. Faire une incision médiane ventrale 1,5-2 cm, environ 0,75-1 cm au-dessus du vagin, d&#39;ouvrir l&#39;abdomen et du péritoine. Éviter les blessures aux organes internes. </li><li> Extérioriser la gauche ou la corne utérine droite avec une pince, tirez-le doucement à travers la membrane de silicium du plat, et de stabiliser le plat sur la terre battue de nouveau. Empêcher vaste tirant ou manipulation, car cela peut provoquer des saignements des vaisseaux utérins et la mort prématurée de la femme et / ou d&#39;embryons. </li><li> Compter les embryons de nouveau pour assurer la tenue de dossiers adéquate des embryons qui ont été injectés. </li><li> Appliquer le gel d&#39;ultrasons sur le uterine cornes à l&#39;image du cœur et pour prévenir la déshydratation. </li><li> L&#39;image du premier embryon à injecter. Vérifiez battement normal du coeur embryonnaire et tenir des registres de l&#39;orientation crânio-caudale et gauche-droite de l&#39;embryon. Si nécessaire, repositionner la corne utérine légèrement pour assurer une orientation correcte. Si cela s&#39;avère difficile, passer à la prochaine embryon. </li><li> Perforer l&#39;utérus soigneusement avec l&#39;aiguille de micro-injection pour positionner l&#39;aiguille à un angle de 45 ° au-dessus de l&#39;embryon, légèrement en dehors du péricarde (Figure 3). Pour l&#39;étiquetage des cellules épicardiques, l&#39;image du coeur en vue de quatre chambre et positionner l&#39;aiguille de sorte qu&#39;il pointe vers la gorge auriculo-ventriculaire (Figure 3). Si l&#39;angle doit être ajusté, retirez l&#39;aiguille, et repositionner. Ne pas ajuster l&#39;angle de l&#39;aiguille dans l&#39;utérus, ce qui risque de casser l&#39;aiguille. Éviter de percer d&#39;autres tissus, tels que les membres ou le placenta. </li><li> Déplacer l&#39;aiguillesur la paroi péricardique et percer avec un mouvement doux, mais rapide. En général, il y aura une certaine résistance, mais le déplacement de l&#39;aiguille trop rapide peut provoquer la pointe de l&#39;aiguille à percer le cœur lui-même. La pointe devrait se retrouver dans l&#39;espace péricardique de la gorge auriculo-ventriculaire. Dans le cas d&#39;une hémorragie péricardique, les globules sera visible en tant que motif de neige comme le blanc. Si c&#39;est le cas, arrêtez l&#39;injection de l&#39;embryon et de passer à un autre embryon. </li><li> Injecter le produit à injecter. Injecter au maximum 700 nl dans l&#39;espace péricardique pour éviter l&#39;effet négatif sur le développement de coeurs. Surveillance de l&#39;injection proprement dite par une légère enflure, temporelle du péricarde. </li><li> Après l&#39;injection, retirez l&#39;aiguille et confirment que le produit à injecter peut encore être éjecté de s&#39;assurer que l&#39;aiguille n&#39;a pas été bouché par des fragments de tissus. </li><li> Repositionner la table de manipulation de l&#39;image et injecter la prochaine embryon. Maintenir le nombre d&#39;embryons injectés au maximum à 3-4 (dans une corne utérine) pour empêcherétendu l&#39;anesthésie, pour permettre embryons de contrôle dans la corne utérine opposée, et de veiller à ce que la procédure n&#39;a pas perturbé le développement embryonnaire. </li><li> Après l&#39;injection le nombre désiré d&#39;embryons, éliminer le gel échographique excès et placez doucement la corne utérine dans l&#39;abdomen dans sa position correcte. </li><li> Fermer l&#39;abdomen de la mère à l&#39;aide d&#39;une couche de fil de suture pour le péritoine et les muscles abdominaux, et une seconde couche de fil de suture à la peau. </li><li> Injecter la souris avec la première dose de médicaments contre la douleur. Utilisez une injection de 0,05-0,1 mg / kg buprénorphine 15 minutes avant de mettre fin à l&#39;anesthésie et trois injections supplémentaires avec des intervalles de 12 h. </li><li> Cesser l&#39;anesthésie et surveiller la souris pour la récupération adéquate de la procédure. Maison de la souris enceinte dans une cage individuelle pour la durée souhaitée de suivi. </li></ol></li></ol>

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tools+for+the+developmental+biologist:+ultrasound+biomicroscopy+of+mouse+embryonic+development.">Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development.</a> Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Dyer, L. 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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les ex vivo protocoles d&#39;injection intra-cardiaques décrits ci-dessus sont conçus pour préserver la fonction myocardique pendant au moins 48 heures à la mi-étape (E9.5-E11.5) des embryons de souris. Ces approches permettent d&#39;injection pour l&#39;injection dans l&#39;espace ciblée de l&#39;ADN ou des cellules. Les quelques exemples présentés dans les figures 1-3 fournissent une preuve de concept pour délimiter ex vivo et in vivo des mécanismes moléculaires des proces...

Il ya plus d&#39;une décennie, les cellules souches embryonnaires humaines (HuESCs) ont été obtenues à partir de blastocystes humains 1. Depuis lors, ces cellules ont fait l&#39;objet d&#39;un important domaine de recherche qui porte sur des questions non satisfaits en biologie du développement humain. HuESCs ont en outre fourni des espoirs en médecine régénérative. Au cours des dernières années, les cellules souches pluripotentes humaines induites (CISP) ont été générés à partir de cellules somatiques du patient spécifique, en fournissant des modèles de maladie génétique 2. Beaucoup dans les protocoles in vitro pour la différenciation des cellules souches pluripotentes embryonnaires ou induites vers différentes lignées cellulaires, y compris les lignées de coeur 3, ont été rapportés. Les cellules différenciées sont souvent phénotypées par analyse de l&#39;ARN et l&#39;expression de la protéine, une immunocoloration, et / ou dans des tests fonctionnels in vitro. Cependant, les dérivés pluripotent de cellules souches doivent être placées dans un environnement approprié embryonnaire afin de vérifier si elles acquièrent entièrement la cell sort de leurs homologues embryonnaires et si ils récapitulent la véritable fonction in vivo en réponse à des signaux régionaux. Alors que l&#39;ingénierie tissulaire est prometteuse, elle ne fournit pas encore tous les repères connus et inconnus de la bonne in vivo développement des tissus embryonnaires 4,5. étiquetage portable avec des colorants ou des vecteurs rétroviraux dans les embryons, y compris les embryons de souris, ont apporté des informations importantes sur l&#39;origine embryonnaire des lignées de cellules au cours du développement cardiaque 6. Par exemple, la teinture injection dans l&#39;espace péricardique d&#39;embryons de souris ex vivo, suivie par la culture in vitro des coeurs isolés, a été utilisé pour marquer des cellules épicardiques et leurs descendants 7. Cependant, colorant et l&#39;étiquetage des cellules rétroviral ont été principalement appliqué à des embryons de souris au début avec les organes encore peu développés, ou des embryons de poulet, qui sont plus facilement accessibles 8. Une exception est le cerveau, ce qui est plus facile à une cible dans l&#39;embryos 9,10. Une telle approche n&#39;a pas encore été appliquée au coeur de la souris embryonnaire battre. Pour compléter l&#39;étiquetage direct avec des colorants ou des virus et d&#39;effectuer le suivi dans la lignée des embryons plus avancés de souris de scène et de souris adultes, l&#39;approche de marquage des cellules a été associée à l&#39;analyse de souris transgéniques à l&#39;aide de la technologie Cre / Lox. L&#39;approche Cre / Lox 11 dispose cependant quelques limitations dues à la spécificité spatio-temporelle des régions régulatrices génomiques utilisés pour diriger l&#39;expression de la recombinase, et l&#39;efficacité de la recombinaison Cre / Lox 12. En outre, cette approche ne répond pas pleinement aux questions spécifiques d&#39;acquisition axée sur la migration des cellules du destin cellulaire, car il ne peut marquer un précurseur après activation de la région régulatrice utilisée pour conduire l&#39;expression Cre. Il peut également ne s&#39;applique pas aux embryons humains à des questions éthiques évidentes. Compte tenu de ces limitations, nous avons conçu une série de nouveaux protocoles pour injecter une variété d&#39;agents de marquage de cellules tels que des colorants fluorescents, des virus, des modulateurs de l&#39;expression génique tels que des shRNA et des vecteurs d&#39;étiquetage de la cellule à base d&#39;ADN, ou des cellules dans l&#39;embryon de souris à E9.5 et des stades ultérieurs de développement dans les régions ciblées de l&#39; cœur. Les injections d&#39;ADN / cellulaires utilisent une loupe binoculaire et un dispositif de micro-injection simple combinée avec la culture ex vivo embryon jusqu&#39;à 48 h, ou le cœur isolé ou de la culture des explants embryonnaires pendant 48-72 h. Nous présentons également un protocole de micro-injection ultrasons médiation dans les coeurs de souris embryonnaires in utero. Cette technique permet de suivre l&#39;évolution des embryons 13 et permet à long terme de suivi des injectates et / ou des cellules marquées. Nous avons constaté que ces approches préservent la fonction de l&#39;organe et fournissent un environnement plus représentatif de l&#39;essai in vitro du potentiel des cellules souches. Il offre également la possibilité de suivre la migrationde marqué et / ou injecté des cellules de contrôler leur destin. En fin de compte, ce qui devrait donner une meilleure compréhension de la structuration du tissu régional et processus biologiques essentiels.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="986">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Setups / Hardware</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:411px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">40 MHz Transducer</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td>MS550S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjector</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to pressurize the injector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Rail system</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rotator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>to rotate glass tube with embryos inside the incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Standard incubator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>5% CO2, 37 C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:175px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;">Discovery. V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Vevo 2100</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjection</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">borosilicate capillary tubes</td>
			<td style="width:175px;">World Precision Instrument</td>
			<td style="width:104px;">KTW-120-6</td>
			<td>1.2 mm external diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pipette puller&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sutter</td>
			<td style="width:104px;">Model P87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">microinjection needles</td>
			<td>Origio-Humagen&#160;</td>
			<td>C060609</td>
			<td>OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Petridishes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Silicon membrane</td>
			<td style="width:175px;">Visualsonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>4.3x4.3 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Play-Doh</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:175px;">Vet One</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hair removal agent&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Nair</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:175px;">Optixcare</td>
			<td>31779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Electrode gel (Signa)</td>
			<td style="width:175px;">Parker</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Suture</td>
			<td style="width:175px;">Sofsilk 5-0</td>
			<td style="width:104px;">S1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ultrasound gel</td>
			<td style="width:175px;">Aquasonic</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)</td>
			<td style="width:175px;">Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.</td>
			<td style="width:104px;">NDC 12496-0757-1</td>
			<td>0.05-0.1 mg/kg in saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glass petridishes</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>60mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Media and culture reagents</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optimem medium</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">51985026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M2 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Eagle Medium</td>
			<td style="width:175px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">BE12-640F</td>
			<td>high glucose and 50% rat serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M16 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rat serum</td>
			<td style="width:175px;">Janvier</td>
			<td style="width:104px;">ODI 7158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pennicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15140-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">oxygen 40%</td>
			<td style="width:175px;">Air liquid</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to oxygenate the embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:104px;">RVJ35882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">matrigel</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">collagen type I</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">354236</td>
			<td>to coat culture dishes for explant culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">culture dishes</td>
			<td style="width:175px;">Dutcher /Orange</td>
			<td style="width:104px;">131020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Injectates</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDCFDA-SE&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Molecular Probes&#160;</td>
			<td>C1165</td>
			<td>25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PGK-GFP-expressing lentivirus&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>~8E9 transducing units/ml DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell labeling and injection in developing embryonic mouse hearts

Test du sort des souches cellulaires dérivés embryonnaires pluripotentes ou dans les protocoles in vitro a conduit à des résultats controversés qui ne reflètent pas nécessairement leur potentiel in vivo. De préférence, ces cellules doivent être placées dans un environnement approprié embryonnaire afin d&#39;acquérir leur phénotype défini. En outre, la lignée cellulaire de traçage études chez la souris après marquage des cellules avec des colorants ou des vecteurs rétroviraux est resté la plupart du temps limitée à des embryons de souris à un stade précoce avec les organes encore peu développées. Pour surmonter ces limitations, nous avons conçu des protocoles de micro-injection standard et échographie médiation pour injecter différents agents dans les régions ciblées du cœur dans des embryons de souris à E9.5 et stades de développement. Explants ou embryons embryonnaires sont ensuite cultivées ou à gauche pour développer in utero. Ces agents comprennent des colorants fluorescents, des virus, des shRNA ou des cellules souches progénitrices dérivées de cellules. Nos approches permettent la préservation de la function de l&#39;organe tout en surveillant la migration et le devenir des cellules marquées et / ou injectées. Ces technologies peuvent être étendues à d&#39;autres organes et seront très utiles pour aborder des questions biologiques clés en biologie du développement.

En utilisant les protocoles d&#39;injection décrites ci-dessus, les cellules peuvent être marquées et / ou injectées dans le cœur de souris embryonnaires. Comme preuve de concept, plusieurs exemples sont présentés dans lequel le protocole d&#39;injection et ex vivo AVC explant, coeur isolé, ou la culture d&#39;embryons ont été combinées ensemble (figure 1). La figure 1 montre la préparation de l&#39;embryon avant l&#39;injection des cell...

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Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Nous décrivons une série de méthodes pour injecter des colorants, des vecteurs d&#39;ADN, des virus et des cellules, afin de contrôler à la fois le destin des cellules et le phénotype des cellules endogènes et greffés dérivés de cellules embryonnaires ou pluripotentes à l&#39;intérieur des embryons de souris au jour embryonnaire (E) de 9,5 et les étapes ultérieures de développement.

Cellule étiquetage et l&#39;injection dans le développement embryonnaires coeurs de souris

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.0K vues.  Aix-Marseille University.  Nous décrivons une série de méthodes pour injecter des colorants, des vecteurs d'ADN, des virus et des cellules, afin de contrôler à la fois le destin des cellules et le phénotype des cellules endogènes et greffés dérivés de cellules embryonnaires ou pluripotentes à l'intérieur des embryons de souris au jour embryonnaire (E) de 9,5 et les étapes ultérieures de développement. 

Vidéo: Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Mesure exocytose dans les neurones en utilisant un étiquetage FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Recherche

Biologie

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

Marquage in vitro des cellules souches embryonnaires humaines pour l&#39;imagerie par résonance magnétique

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Préparation d&#39;embryons pour la microscopie électronique des Drosophile Tube cardiaque embryonnaire

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Rétro-orbitaire d&#39;injection chez le poisson zèbre pour adultes

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Enregistrements aspiration simple cellule à partir de cônes photorécepteurs de la souris

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Vidéo analyse bioinformatique des droits de croissance de la tige colonie de cellules embryonnaires

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

L&#39;imagerie in vivo et des traitements thérapeutiques dans un modèle de souris orthotopique de cancer des ovaires

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un système d&#39;<em&gt; Ex vivo</emLa culture&gt; de pancréas embryonnaire

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

Séparation de souris embryonnaires ectoderme visage et Mesenchyme

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...