Un profil SEC est un moyen puissant d’analyser la qualité d’une protéine. L’objectif est de recueillir un profil SEC pour une protéine membranaire en utilisant la fluorescence, ce qui peut informer sur la qualité de l’échantillon. La CEMN utilise de petites quantités d’échantillons et peut être effectuée pour la purification, est relativement simple et peut être effectuée sur de l’équipement disponible dans de nombreux laboratoires.
Jack Wright, un scientifique principal des protéines de Peak Proteins, fera la démonstration de la procédure. Commencez par préparer les palettes cellulaires en décongelant la palette cellulaire stockée à moins 80 degrés Celsius à température ambiante pendant 15 minutes, ou jusqu’à ce que l’échantillon ne soit plus congelé. Déplacez immédiatement l’échantillon sur la glace.
Pour remettre en suspension et solubiliser l’échantillon, ajoutez deux millilitres du tampon de solubilisation à la palette de cellules. Incuber avec une inversion de bout en bout à quatre degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes. Ajoutez ensuite un stock de détergent prémélangé pour obtenir une concentration finale de 1% de dodécyl maltoside, ou DDM, et de 0,1% d’hémisuccinate de cholestérol, ou CHS.
Solubiliser pendant 30 minutes avec une inversion de bout en bout à quatre degrés Celsius. Pour effectuer une étape de centrifugation à basse vitesse, centrifuger l’échantillon dans une centrifugeuse de paillasse à l’aide d’un godet pivotant et centrifuger à 2000g pendant 15 minutes. Effectuez ensuite une centrifugation à grande vitesse en transférant le surnageant de la centrifugation à basse vitesse vers des tubes d’ultracentrifugation à l’aide d’une aiguille émoussée fixée à une seringue de cinq millilitres.
Assurez-vous de ne pas déranger la palette. Après avoir équilibré les paires de tubes, placez-les dans un rotor d’ultracentrifugation à angle fixe et centrifugez à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes à 250 000 g. Préparez la chromatographie liquide à protéines rapides, ou système FPLC en remplissant le système avec une chromatographie d’exclusion de taille, ou tampon SEC, et en purgeant les pompes d’air.
Connectez la colonne SEC au FPLC, en veillant à ce qu’aucun air ne pénètre dans la colonne. Prééquilibrer la colonne SEC en la lavant dans 1,5 fois les volumes de colonne d’eau distillée et filtrée de qualité laboratoire, suivie de 1,5 fois les volumes de colonne de tampon SEC au débit et à la pression recommandés pour la colonne. Pour exécuter l’expérience SEC, transférez le surnageant de l’étape de centrifugation à grande vitesse vers une seringue d’un millilitre à l’aide d’une aiguille émoussée fixée à la seringue.
Définissez la boucle d’exemple à charger. Remplissez trop une boucle d’échantillon de 500 microlitres en injectant 600 à 700 microlitres de l’échantillon de la seringue dans l’orifice de chargement. Ensuite, injectez l’échantillon de la boucle dans la colonne en le vidant avec quatre millilitres de tampon SEC au débit et à la pression recommandés.
Exécutez la colonne au même débit jusqu’au passage de 1,5 fois le volume tampon et commencez à collecter 90 fractions de 0,2 millilitre après passage de 0,25 fois le volume de la colonne. À l’aide d’une pipette multicanal, transférer 90 microlitres d’eau distillée de qualité laboratoire d’un réservoir à chaque puits d’une plaque opaque à fond plat de 96 puits. Ensuite, transférez les 10 microlitres des échantillons d’une plaque de 96 puits à la plaque opaque, à fond plat, de 96 puits, et placez la plaque de puits dans un lecteur de plaque.
Pour le GFP marqué par fluorescence, définissez l’excitation aussi près que possible de 488 nanomètres et détectez l’émission fluorescente aussi près que possible de 507 nanomètres avant de mesurer le signal. L’étude de la plage dynamique et des limites inférieures de la protéine fluorescente verte améliorée, ou détection EGFP pour le lecteur de plaques, a indiqué que le lecteur de plaque avait une limite de détection inférieure de 30 nanogrammes et une plage dynamique allant jusqu’à 500 nanogrammes de protéines marquées EGFP par puits avant la saturation du signal. La conversion des volumes d’élution en Kav et son tracé en fonction des masses moléculaires logarithmiques ont permis d’estimer le poids moléculaire des récepteurs couplés aux protéines G par interpolation de la courbe standard.
Les conditions optimales d’extraction membranaire ont été explorées en testant le DDM et le laurylmaltose néopentyl glycol contre une extraction sans détergent avec un copolymère d’acide maléique styrène. L’effet de l’addition de ligand sur le profil chromatographique d’exclusion de taille de fluorescence a été étudié en ajoutant de la sphingosine-1-phosphate, ou S1P, à l’échantillon pendant la solubilisation. L’échantillon solubilisé en présence de S1P a montré une trace supérieure avec une agrégation réduite.
L’étude de la stabilité à long terme du récepteur de la sérotonine 5HT2AR dans différentes conditions a indiqué que la protéine dans les particules lipidiques d’acide maléique styrène restait stable plus longtemps, même à des températures défavorables. Le temps écoulé entre le point de solubilisation et le passage de l’échantillon dans la colonne SEC est critique. Il ne doit pas y avoir de pauses et l’échantillon doit être conservé au froid.
Après FSEC, une compréhension du meilleur constructeur, détergent ou tampon sera acquise. Cela permet d’optimiser la purification des protéines et de soutenir la caractérisation biophysique et structurelle en aval.
