Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés sur la composition et l’organisation dynamique des complexes de protéines photosynthétiques dans la membrane thylakoid végétale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’analyse des interactions fonctionnelles entre les complexes protéiques indigènes et élucide la plasticité de l’organisation complexe protéique dans des conditions environnementales variables. Installez la roulette de gel de huit centimètres par plaques de 10 centimètres selon les instructions du fabricant à l’aide d’espaceurs de 0,75 millimètre.
Placez un mélangeur dégradé sur une plaque à remuer et connectez-le à la pompe périssaltique par tube. Fixez une aiguille de seringue à l’autre extrémité du tube et placez l’aiguille entre le verre et la plaque d’aluminium. Placez un agitateur magnétique dans la chambre lourde.
Préparez des solutions d’acrylamide à 3,5 % et 12,5 % dans des tubes de centrifugeuse conique de 15 millilitres, comme le détaile le protocole textuel à utiliser pour le gradient gel de séparation. Pour éviter une polymérisation prématurée, gardez les tubes de centrifugeuse sur la glace tout en préparant les solutions. Ajoutez 5% APS et TEMED juste avant de pippetting les solutions au mélangeur de gradient.
Pipette les solutions de 12,5% à la chambre lourde. Retirez les bulles d’air du canal reliant la chambre légère et lourde en ouvrant la vanne reliant les deux chambres permettant à la solution d’entrer dans la chambre lumineuse. Fermez la vanne et pipette les traces de solution de retour à la chambre lourde.
Enfin, pipette la solution de 3,5% à la chambre légère. Allumez l’agitateur magnétique. Ouvrez les vannes et allumez la pompe périssaltique.
Laissez les solutions de gel circuler entre la plaque de verre et d’aluminium à un débit d’environ 0,5 millilitres par minute. L’aiguille doit être au-dessus du liquide en tout temps. Lorsque les chambres lourdes et légères se sont vidées, remplissez-les d’eau ultrapure.
Et laisser l’eau superposer doucement la surface du gel. La polymérisation du gel prend environ une à deux heures à température ambiante. Préparer la solution d’acrylamide à 3 % pour le gel empilant à température ambiante.
Pipette le gel d’empilage sur le gel de séparation polymérisé et placer un peigne gel échantillon entre le verre et la plaque d’aluminium en évitant les bulles d’air. Après avoir laissé le gel polymériser de 30 à 60 minutes à température ambiante, retirer délicatement le peigne sous de l’eau ultrapure. À ce stade, le gel peut être stocké à quatre degrés Celsius positifs dans des conditions humides pendant quelques jours.
Diluer les thylakoids isolés avec un tampon glacé de 25BTH20G à une concentration finale de chlorophylle d’un milligramme par millilitre. Préparez deux tubes pour chaque échantillon de thylakoid pour effectuer la solubilization de bêta-DM et de digitonin. Maintenant, ajoutez un volume égal de tampon détergent.
Mélanger délicatement le détergent et l’échantillon de thylakoid avec une pipette et éviter de faire des bulles d’air. Solubiliser les thylakoids pendant deux minutes sur la glace pour la solubilisation bêta-DM. Ou 10 minutes à température ambiante avec mélange doux continu sur un rocker ou shaker pour la solubilisation digitonine.
Après l’incubation, enlever le matériau insolubilisé par centrifugation à 18 000 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius positifs. Transférez le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et ajoutez 1/10 volume de tampon bleu brillant Coomassie à l’échantillon. Installez le gel dans un système d’électrophoresis vertical.
Remplissez la chambre tampon supérieure d’un tampon cathodique bleu et versez un tampon d’anode dans la chambre tampon inférieure. Chargez les échantillons de thylakoid dans les puits. Démarrez l’électrophorèse et augmentez progressivement la tension indiquée dans le protocole texte.
Faire fonctionner le gel à quatre degrés Celsius positif, soit à l’aide d’une pièce froide, soit en ajustant la température du gel à l’aide d’un système de refroidissement. Modifiez le tampon cathodique bleu en tampon cathodique clair lorsque le front de l’échantillon a migré environ 1/3 du gel. Après la course électrophoretic, numérisez le gel à l’aide d’un scanner photo pour l’archivage d’images.
Pour effectuer 2-SDS PAGE assembler le système d’électrophoresis vertical à l’aide d’espaceurs d’un millimètre. Préparez un gel SDS standard avec un peigne 2D tel que décrit dans le protocole texte. Couper la voie à partir du gel BN et la placer dans un tube de cinq millilitres.
Ajouter ensuite deux millilitres de tampon Laemmli et incuber la bande pendant 45 minutes avec des secousses douces à température ambiante. Placez la voie à l’aide d’un espaceur sur le gel en évitant les bulles d’air. Pipette cinq microlitres de marqueur de poids moléculaire sur un morceau étroit de papier filtre et placer le papier dans le puits standard.
Pour sceller la bande de gel BN et le papier marqueur verser un agarose de 0,5% en cours d’exécution tampon sur le dessus de la bande de gel et lui permettre de se solidifier. Effectuer l’électrophorèse selon les protocoles standard. Après la course électrophoretic visualiser les protéines avec supro ruby tache ou coloration d’argent.
Les résultats représentatifs des modèles complexes de protéines thylakoid des échantillons bêta-DM et numérisés-solubilisés sont montrés ici. Les petits complexes migrent plus rapidement pendant la course électrophoretic et sont donc dans la partie inférieure du gel. Alors que les grands complexes sont dans la partie supérieure du gel.
La digitonine préserve généralement les complexes protéiques dans les assemblages plus grands, tandis que le bêta DM interfère avec les interactions protéine-protéine labile entre les complexes. La composition sous-unique des complexes protéiques de bêta-DM et de thylakoids numérisés-solubilized sont présentés ici. Les sous-units de chaque complexe se trouvent à partir de la ligne verticale au-dessous du complexe aligné.
En principe, chaque tache dans le gel 2D représente une protéine individuelle. Mais dans la pratique, plusieurs protéines de même masse moléculaire peuvent être présentes en un seul endroit. L’identification des taches est basée sur l’analyse de spectrométrie de masse.
Après l’application de cette procédure, on peut continuer avec d’autres méthodes comme la microscopie électronique et l’analyse à particule unique des complexes protéiques épuutés du gel natif bleu afin d’obtenir des aperçus structurels dans les complexes protéiques. Pour identifier les sous-unités de protéines inconnues, les taches protéiques individuelles de la PAGE SDS bidimensionnelle peuvent être analysées à l’aide de spécifications de masse. N’oubliez pas que le travail avec l’acrylamide et la digitonine peut être extrêmement nocif et des précautions telles que le port de gants de protection doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
