Notre méthode fournit un moyen rapide de comprendre l’impact fonctionnel des variantes d’Ube3a, une ubiquitine ligase qui cause le syndrome d’Angelman et est fortement liée à une forme génétique de l’autisme connue sous le nom de syndrome Dup15q. La caractérisation de l’activité de l’ubiquitine ligase est traditionnellement laborieuse et lente, et de telles méthodes sont difficiles et ne se prêtent pas vraiment à caractériser les centaines de variantes identifiées pour Ube3a. Le syndrome d’Angelman est causé par la délétion du gène maternel Ube3a, tandis que le syndrome Dup15q est causé par la duplication de l’Ube3a maternel, il est donc important de déduire comment les variantes faux-sens ont changé l’activité de l’enzyme Ube3a, et c’est quelque chose qui est difficile à faire sans tester empiriquement chaque variante.
La démonstration de la procédure sera assurée par Jalin Stelzer, technicien de recherche dans mon laboratoire. Commencez par effectuer les tests sur des cellules HEK293T, cultivées dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco à 37 degrés Celsius, avec 5% de dioxyde de carbone dans un récipient humidifié, comme décrit dans le manuscrit. Dans une enceinte de biosécurité, plaquer les cellules HEK293T en suspension sur une plaque à fond plat 96 puits traitée par culture tissulaire et incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés.
Le deuxième jour, transfectez les cellules dans une armoire de biosécurité avec des plasmides rapporteurs Firefly et Renilla luciférase, et des plasmides Ube3a en trois exemplaires. Effectuer les transfections dans un volume total de 10 microlitres par puits. Créer un mélange maître pour les transfections pour chaque variante dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
Après l’incubation, agiter doucement le mélange de transfection en tapotant le tube, puis ajouter 10 microlitres du mélange de transfection directement dans le milieu de croissance existant dans les puits. Ensuite, retournez les cellules dans l’incubateur et laissez les plasmides s’exprimer pendant 48 heures. À l’aide d’un microscope à fluorescence, surveiller l’efficacité de la transfection par fluorescence GFP.
Plus de 80% des cellules devraient exprimer la GFP après 48 heures. Aspirez soigneusement les milieux de culture des cellules HEK293T transfectées, puis lavez les cellules avec du PBS froid. Aspirez le PBS.
Ajouter 25 microlitres de tampon de lyse non dénaturant pour la lyse cellulaire et incuber pendant 15 minutes sur la glace en balançant doucement. Ensuite, ajoutez 20 microlitres du lysat résultant dans une nouvelle plaque de dosage de 96 puits contenant 100 microlitres d’un réactif de substrat de luciférase Firefly et mélangez doucement la plaque en tapotant. Chargez la plaque jusqu’à un lecteur de plaques et mesurez la luminescence à l’aide d’un détecteur supérieur avec une hauteur de lecture d’un millimètre et un temps d’intégration d’une seconde.
Immédiatement après avoir lu la luminescence luciférase Firefly, ajoutez 100 microlitres de substrat de Renilla luciferase aux puits, ce qui éteint l’activité de la luciférase Firefly tout en évaluant l’activité de Renilla luciferase. Mélanger les échantillons par agitation douce sur plaque et mesurer à nouveau la luminescence pour évaluer l’activité de Renilla luciferase. Comparez l’activité relative des protéines variantes en quantifiant les réponses du rapporteur et en normalisant la valeur de Firefly et Renilla pour chaque variante par rapport au type sauvage Ube3a.
Les cellules HEK293T transfectées avec des quantités croissantes de plasmides codant pour Ube3a de type sauvage montrent une augmentation linéaire de la réponse BAR. Le test BAR identifie les variantes des plasmides liées à la maladie, démontrant la précision et la généralité de cette méthode. Le criblage BAR pour 152 variantes d’Ube3a montre une perte bénigne de fonction et un gain de mutations fonctionnelles par rapport à Ube3a de type sauvage.
Le gain de substitution de la fonction glutamate, la perte de la substitution de la proline et une autre perte de fonction de substitution de l’arginine à la position 588 d’Ube3a ont produit des effets radicalement différents, soulignant ainsi l’importance de l’évaluation empirique des variantes. Le diagramme thermique montre les résultats BAR normalisés pour une analyse mutationnelle complète à la position 588 dans Ube3a. L’ombrage blanc représente les niveaux d’activité Ube3a de type sauvage, l’ombrage bleu indique la perte de fonction et l’ombrage rouge indique le gain de mutations fonctionnelles.
Au-delà des implications cliniques de nos travaux, Ube3a fait partie de la famille des ubiquitines ligases du domaine HECT, qui possèdent toutes le domaine catalytique HECT conservé. Et je pense que l’un des aspects fascinants de notre travail est qu’il fournit de riches données sur la fonction de structure sur Ube3a, et cela peut être utilisé pour acquérir une compréhension mécaniste plus profonde pour cette classe d’enzymes.
