ESB admet un financement par le Prix du directeur des NIH Innovateur Nouvelle (DP2 OD002002-01), le NIH subvention défi 1RC1MH088182-01, le NIH Opportunités Grand-Grant 1RC2DE020919-01, le NIH 1R01NS067199-01, la NSF (0835878 et 0848804), le Programme McGovern Institute Award Neurotechnology , le ministère de la Défense, NARSAD, la Fondation Alfred P. Sloan, Jerry et Marge Burnett, le Prix de recherche SFN pour l&#39;innovation en neuroscience, le MIT Media Lab, la Fondation Benesse, et le Wallace H. Coulter Foundation.

1. Construire Clamp stéréotaxique <ol><li> La pince stéréotaxique est utilisé pour attacher le tableau injecteur à l&#39;stereotax, de sorte que les injecteurs sont parallèles au bras stéréotaxique. </li><li> Chaque laboratoire ne nécessite qu&#39;une seule pince, sauf s&#39;il est prévu que plus d&#39;une chirurgie peuvent avoir lieu simultanément. Dans ce cas, faire le même nombre que le nombre maximum prévu de chirurgies simultanées. Il pourrait aussi être conseillé de faire une supplémentaire, en cas de dommages à la première. </li><li> Pour rendre le collier stéréotaxique, premièrement, d&#39;un diamètre de 1,5 mm extérieur (OD) canule en acier est coupé à deux pouces de longueur, et l&#39;une des extrémités est Dremeled jusqu&#39;à ce plat. </li><li> Ensuite, un petit morceau (environ 0,5 x 0,5 cm) est découpée de PCB proto-pension, pour être utilisé comme une entretoise. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un laser cutter afin de s&#39;assurer que toute réduction faite sont perpendiculaires à la surface du matériau, deux rectangles identiques (1 / 2 &quot;x 3 / 8&quot;) sont coupés de 1 / 8 &quot;bâches acrylique, chaque rectangle ayant deux trous circulaires dans les coins opposés du rectangle. Le premier trou a un diamètre de 1,5 mm, et est juste assez grand pour contenir la canule métallique hermétiquement. Le deuxième trou a un diamètre 1 / 16 &quot;(figure 1C). </li><li> La canule métallique est insérée dans le trou de 1,5 mm d&#39;un rectangle, puis dans le trou de 1,5 mm de la seconde. L&#39;extrémité inférieure de la canule est aligné avec la face inférieure du rectangle en bas, formant la forme d&#39;un bâton de hockey. </li><li> Tout en gardant l&#39;entretoise bien eu lieu entre les deux rectangles, cette structure est cimenté par l&#39;aide de la colle chaude autour des trous de 1.5mm canule et, en prenant soin d&#39;éviter de coller l&#39;entretoise sur les rectangles. Pâte à modeler peut être utile pour maintenir les choses ensemble durant ce processus. </li><li> Une fois la colle séchée, une vis 1-72 est insérée dans le trou de 1 / 16 de la partie supérieure des rectangles. Puis un écrou hex 1-72 est vissé sur l&#39;extrémité de la vis de 1-72, et resserré. Les vis et écrou servent à maintenir la pince ensemble. </li><li> Pour fixer l&#39;écrou sur la face inférieure du rectangle en bas, de petites quantités de 5-minute époxy sont abandonnés sur le bord de l&#39;écrou, sans permettre à l&#39;époxy de pénétrer dans les filets de l&#39;écrou ou la vis. Toute la pâte à modeler est enlevée, et il est confirmé que l&#39;entretoise peut être maintenu fermement en place en serrant la vis. </li></ol> 2. Préparer le système pour le tableau personnalisé injecteur: Hamilton pompe et stereotax <ol><li> Le système de réseau injecteur peut être personnalisé pour n&#39;importe quel ensemble de coordonnées dans le cerveau. </li><li> Le premier utilisateur localise coordonnées des sites d&#39;injection souhaitée dans une souris (ou d&#39;autres espèces) Atlas du cerveau, la conversion des coordonnées appropriées utilisées par les stereotax (ici, X, Y et Z les coordonnées). Le nombre de sites d&#39;injection (trois dans les Figures 1A et 1B) seront ci-après appelé k. </li><li> nombre k de 10 seringues Hamilton ul sont placés dans une seringue d&#39;injection / soutirage comme celui d&#39;un appareil de Harvard. </li><li> Ensuite, trois pieds de long morceaux de tuyaux en polyéthylène sont solidement attachés à l&#39;aiguille de chaque seringue Hamilton. </li><li> Pour chaque morceau de tube en polyéthylène, un F-252 manches tube de Upchurch Scientific est glissé sur l&#39;extrémité ouverte et attachée à un adaptateur de tuyau P-627 en utilisant l&#39;écrou et la ferrule incluse, également de Upchurch Scientific. </li></ol> 3. Construire le tableau personnalisé injecteur <ol><li> Chaque tableau injecteur est adapté à l&#39;ensemble de coordonnées que l&#39;utilisateur choisit. Cependant, pour des ensembles de coordonnées qui ne diffèrent que par une traduction et / ou de rotation, le même tableau injecteur peut être utilisé. </li><li> Considérant que le X relative et coordonnées Y des sites d&#39;injection, les trous sont percés dans k un PCB proto-conseil d&#39;épaisseur de 1 / 32 &quot;, avec le même espacement relatif. Ces trous sont forés à l&#39;aide d&#39;un moulin et d&#39;un mini Modela 0.011&quot; foret de diamètre de l&#39;Université McMaster-Carr. Veillez à utiliser un faible taux de forage (Z-vitesse) pour éviter de casser ou de l&#39;usure du foret. Avant de retirer la carte du moulin, un rectangle est percé de petits trous autour de l&#39;aide d&#39;un peu plus grand foret de diamètre 1 / 32 &quot;, d&#39;éviter de porter le plus petit code pour l&#39;usine mini peut être généré facilement à l&#39;aide de MATLAB;. Échantillon code est fourni dans les fichiers suivants. <ol class="lroman"><li> generate.m - code MATLAB pour générer du code à partir des coordonnées souhaitées Modela </li><li> holes_ex.rml - Code Modela pour sonnerie de forage (huit trous) en proto-pension </li><li> outline_ex.rml - Code Modela pour rectangle autour des trous de forage </li></ol></li><li> 245 um um OD/100 diamètre interne (ID) tube capillaire en silice fondue, disponible à partir Polymicro Technologies, est coupé en nombre k de 3 morceaux de pouce. Celles-ci comprennent les injecteurs individuels. Une pièce à usage de tubes capillaires est fourré danschacun des trous, pour déblayer les débris, sans obstruer les injecteurs réelle. Les injecteurs sont ensuite insérés à moitié dans chaque trou, de sorte qu&#39;ils sont fermement maintenue et parallèles les uns aux autres. Les injecteurs sont époxy au conseil d&#39;administration, formant la structure de la matrice de l&#39;injecteur. Tout ce qui reste est de couper les injecteurs à la bonne longueur. </li><li> Le tableau de l&#39;injecteur est fixé à la pince stéréotaxique en plaçant un coin de la proto-pension entre les rectangles acrylique, puis en serrant la vis de la pince stéréotaxique. Ensuite, la canule en métal de la pince est attaché à la stereotax, en utilisant le mécanisme de fixation de l&#39;stereotax. </li><li> Tous les suivants se fait sous un microscope. Pour l&#39;un des injecteurs extérieure (qui est, celui qui peut être approché par le côté avec une arête droite, sans heurter aucune des autres injecteurs), la pointe au-delà du fond de la proto-pension est coupé avec des ciseaux. Pour les injections corticales, il est approprié d&#39;avoir l&#39;injecteur s&#39;étendant approximativement 5mm au-delà de la surface de la proto-pension. Pour plus d&#39;injections, ce nombre peut être augmenté par l&#39;augmentation correspondante de la profondeur. La pointe est aplatie avec un outil Dremel. Conseils injecteur peut également être sol avec un angle comme une précaution supplémentaire contre le colmatage, si la précision dans la profondeur est moins importante. </li><li> Ensuite, un point de référence stable est choisi dans la portée du bras stéréotaxique, et le tableau de l&#39;injecteur est déplacé de sorte que la pointe aplatie de l&#39;extérieur injecteur, est à ce point de référence. </li><li> Une seconde injection est choisie, avec ses coordonnées correspondantes. Considéré comme la différence relative en hauteur (direction z) entre les coordonnées injecteur premier et deuxième. Le tableau de l&#39;injecteur est déplacée le long de l&#39;axe Z par cette distance relative. L&#39;injecteur est coupé et la seconde Dremeled à la bonne longueur, de sorte que la pointe de l&#39;injecteur seconde est maintenant à plat et à la hauteur du point de référence. Le tableau injecteur peut être déplacé dans les directions X et Y pour faciliter la comparaison de la pointe d&#39;injecteur avec le point de référence. </li><li> Ce processus d&#39;ajustement est répétée pour les injecteurs restants. </li></ol> 4. Assemblage de l&#39;ensemble du système <ol><li> La pince stéréotaxique et personnalisés array injecteur, tous deux déjà construits, sont requises pour cette partie. </li><li> L&#39;extrémité arrière de chaque injecteur (la fin qui n&#39;a pas été taillée) est inséré dans un bleu à manches F-240 tubes et, en utilisant un écrou de P-235 et P-200 férule d&#39;Upchurch Scientific, est fixé à l&#39;adaptateur fileté déjà connecté à la pompe à Hamilton par des tuyaux en polyéthylène. Les instructions du fabricant peuvent être consultés pour plus de détails. </li><li> En utilisant une aiguille de calibre 27, l&#39;huile de silicone est injectée dans le dos des seringues Hamilton afin que le système entier est rempli de la seringue de Hamilton à la pointe de l&#39;injecteur, sans bulles d&#39;air du tout. </li><li> Comme les seringues Hamilton sont re-placé dans la pompe à Hamilton, le plus grand volume possible de l&#39;huile de silicone est maintenu dans les seringues. </li><li> Si l&#39;expérience nécessite plus de seringues que la pompe est conçue pour les (deux dans ce cas), les seringues peuvent être espacées de petits morceaux de plastique (p.ex., casquettes aiguille) pour les maintenir parallèles les uns aux autres, et de s&#39;assurer que toutes les pièces sont poussé par la pompe dans la même mesure. Ou encore, un kit de mise à niveau multi-rack peuvent être achetés auprès de Harvard Apparatus à détenir jusqu&#39;à 10 seringues à la fois. </li></ol> 5. Injections / chirurgie <ol><li> Le processus d&#39;injection avec un parallèle injecteur est très similaire à celle de l&#39;injection avec une pipette simple. </li><li> Il est essentiel d&#39;utiliser des recharges lente / infuser taux tout au long de ce processus, parce que le pompage rapide pourrait mettre l&#39;accent sur l&#39;articulation entre les tubes de petits et grands. Poids max Taux: 2 l / min pour le chargement de virus, et 0,1 l / min pour infuser le virus. </li><li> Une souris anesthésiée est placé dans le stereotax, et reste anesthésié toute l&#39;expérience. </li><li> Préparer la souris si nécessaire. Par exemple, avec un scalpel, une seule coupe est faite en bas de la ligne médiane de la peau, d&#39;entre les yeux entre les oreilles. La peau est tirée en arrière pour exposer le crâne, et le fascia est nettoyée. Une pipette de verre tiré est attachée à la stereotax. Les positions des barres d&#39;oreilles sont ajustés jusqu&#39;au bregma et lambda sont alignés à la même hauteur, et afin que la ligne reliant entre eux est parallèle à l&#39;axe des Y de l&#39;stereotax. Les axes de la stereotax sont orientés selon le système de coordonnées dans lequel les coordonnées d&#39;injection ont été calculés. La stéréotaxie est remis à zéro à la pointe de la pipette en verre au bregma, puis l&#39;embout est positionné légèrement au-dessus du crâne à l&#39;X et Y coordonnées de l&#39;un des sites d&#39;injection. </li><li> En utilisant une fraise de dentiste, le crâne en dessous de la pointe est bien rogné jusqu&#39;à ce qu&#39;il y reste une couche extrêmement fine d&#39;os. La pipette en verre peut être inférieureed et a grandi pour vérifier que le trou foré est centrée à la position correcte. En utilisant une aiguille de calibre 30, un petit morceau de la couche est doucement égrappés, à l&#39;X et Y coordonnées correctes, de sorte que la dure-mère est exposée. Ce trou doit être juste assez grand pour accueillir l&#39;un des injecteurs (0,25 de large). Voir Figure 1D pour le diagramme. De cette façon, les petits, 0.25mm trous larges sont faites dans le crâne, à l&#39;X et Y coordonnées correspondant à chaque site d&#39;injection. </li><li> La pipette en verre est jeté dans un contenant pour objets pointus, et le tableau personnalisé injecteur est attaché à l&#39;aide de la pince stereotax stéréotaxique. </li><li> Afin de régler correctement l&#39;angle de la matrice de l&#39;injecteur, deux injecteurs extérieurs sont choisis pour être calibré à un point de référence donné, comme suit. Après l&#39;un des injecteurs est jumelé avec le point de référence, considérer la relative X et Y les distances entre les sites d&#39;injection par rapport à cet injecteur et un autre. Les axes de la stereotax est ajustée de sorte que toute matrice injecteur est déplacé dans le X et Y. directions par ces distances relatives. Si l&#39;injecteur seconde n&#39;est pas maintenant aligné sur le point de référence, la canule métal est desserré et tourné. Ce processus est répété itérativement jusqu&#39;à ce que le réseau de l&#39;injecteur est inclinée correctement. </li><li> Avant de remplir les injecteurs par le virus, les injecteurs sont remplis d&#39;huile de silicone jusqu&#39;à ce que les seringues sont au point 2 pl (ou plus). Cela donne une zone tampon, de sorte que les bulles d&#39;air ou l&#39;obstruction à la pointe peut être facilement retiré en poussant l&#39;huile avant d&#39;utiliser la pompe à Hamilton, sans avoir à recharger l&#39;ensemble du système avec de l&#39;huile de silicone à l&#39;arrière de la seringue, comme décrit précédemment. </li><li> Une pièce stérile de Parafilm est placée sur le crâne, et les injecteurs sont doucement abaissée sur le Parafilm. Pour les coordonnées des profondeurs très variables, une coutume blanchi une partie (par exemple un objet en escalier) pourrait faciliter le chargement. </li><li> Les pièces suivantes supposent que 1 ul de virus est d&#39;être chargé à chaque site (les quantités suivantes doivent être revus à la baisse si les plus petites quantités sont souhaités). Afin de garantir que&gt; 1 pl de virus est injecté dans chaque site, 1,5 l de virus est à la pipette sur l&#39;Parafilm ou un escalier à l&#39;extrémité de chaque injecteur. </li><li> Avec le taux de remplissage de la pompe à Hamilton mis à 1 l / min, 1,2 ul du virus est rempli dans chaque injecteur. </li><li> La pointe de la plus longue de l&#39;injecteur est remis à zéro au bregma, puis le tableau de l&#39;injecteur est déplacé à l&#39;X et Y coordonnées de l&#39;injecteur. Si colmatage est un problème, dire si de nombreuses cibles profondes sont impliqués: avant même d&#39;insérer les astuces injecteur dans le cerveau, il est parfois conseillé de commencer l&#39;infusion de la pompe, jusqu&#39;à ce que le virus peut être vu sortant de tous les conseils injecteur. Cela supprime les bulles d&#39;air à l&#39;extrémité d&#39;injection, et assure également qu&#39;il n&#39;ya pas de colmatage. Dans le cas de colmatage, la pompe à Hamilton est d&#39;insuffler une impulsion brève à une vitesse supérieure de 2 pl / min, pour doucement vider colmatage. </li><li> Le tableau de l&#39;injecteur est alors abaissée, à travers les petits trous faits avec des aiguilles de calibre 30, à la bonne profondeur Z. </li><li> 1 pl de virus est injecté par chaque injecteur, à 0,1 ul / min. </li><li> Les injections sont laissés seuls pendant 30 minutes. </li><li> Après le tableau de l&#39;injecteur est lentement extraite du cerveau, la pompe à Hamilton est d&#39;insuffler à la même vitesse de 0,1 l / min, afin de vérifier le colmatage dans chaque injecteur. </li><li> Puis les injecteurs sont nettoyées par le remplissage et infuser 1,5 ul d&#39;éthanol à 2 pl / min. </li><li> Enfin, les injecteurs sont rechargées avec de l&#39;huile de silicone pour maintenir la zone tampon de 2 pi dans chaque seringue Hamilton. </li><li> Tous les équipements doivent être stérilisés avant et après la procédure, conformément à la biosécurité de votre institution et les protocoles d&#39;utilisation d&#39;animaux. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Le réseau parallèle injecteur accélère une chirurgie à peu près par un facteur égal au nombre d&#39;injecteurs, sans compter les temps d&#39;installation et de récupération, bien que les temps individuels dépendra de la compétence du praticien. Pour une injection 1 microlitre, nous avons généralement vu l&#39;expression des lentivirus dans une sphère d&#39;environ 1mm de diamètre (figure 1E). La précision de l&#39;injection a été telle que la variabilité dans le positionnement de pointe, d&#39;un essai à, a été d&#39;environ 45 microns (déviation standard de la distance de la position de la pointe à la position de pointe destiné). <img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Conception, mise en œuvre, et l&#39;utilisation d&#39;une matrice d&#39;injection du virus parallèle. Un schéma, du système d&#39;injection réseau parallèle, montrant une configuration triple injecteur, pour trois injections simultanées. B, photographie d&#39;un tableau injecteur triple parallèle comme schématisé Une . <strong&gt; C, pince stéréotaxique, représentées en trait du haut D, l&#39;illustration de la technique pour l&#39;efficacité, les dommages-minimisant, ouverture de trous dans le crâne d&#39;injecteur d&#39;insertion dans le cerveau:. avec une fraise de dentiste, mince du crâne jusqu&#39;à l&#39;épaisseur ~ 50 microns, puis utilisez la pointe d&#39;une aiguille forte pour ouvrir une petite craniotomie. E, image de fluorescence montrant channelrhodopsin-2 (CHR2)-GFP cellules marquées dans les trois régions corticales de souris, et visés par le tableau triple injecteur montré en B.

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	<li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+halorhodopsin+variants+for+improved+genetically-targetable+optical+neural+silencing.">High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. , (2009).</li><li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration.">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li><li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain.">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity,+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li><li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells.">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li><li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels.">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li></ol>

Toutes les procédures ont été en conformité avec le Guide du NIH pour les animaux de laboratoire et approuvés par le soin des animaux du MIT et de l&#39;emploi et des comités de biosécurité.

Ces dernières années, un certain nombre d&#39;organismes génétiquement codés sensibilisateurs optiques ont permis neurones à être activé et fait taire in vivo d&#39;une manière temporellement précise, en réponse à des impulsions brèves de lumière (par exemple, 1,4,5,6,7,8 , 11). Une méthode clé avec laquelle les neurones ont été sensibilisés à la lumière dans le cerveau des mammifères, se fait par des virus tels que les lentivirus et virus adéno-associés (AAV), qui peuvent délivrer des gènes codant pour des opsines au cerveau des animaux allant des souris aux singes, dans un manière sûre et durable (par exemple, 2,9,10). Virus laisser le temps d&#39;exécution plus rapide que ne le font les transgéniques, en particulier pour les organismes qui ne sont pas des organismes modèles génétiques comme les rats et les singes, et pour opsines peut permettre des niveaux d&#39;expression élevés qui peuvent ne pas être possible dans des scénarios transgéniques. Ici nous démontrons une gamme parallèle injecteur capable de créer, dans un délai rapide &quot;, au niveau circuit transgéniques», permettant à l&#39;ensemble des structures du cerveau en 3 dimensions pour être viralement ciblée d&#39;un gène, en une seule étape chirurgicale. Le tableau injecteur comprend un ou plusieurs pompes volumétriques que chaque lecteur un ensemble de seringues, dont chacun se nourrit dans un verre de silice-polyimide / capillaire via un connecteur haute pression tolérant. Les capillaires sont de taille, puis inséré dans, endroits désirés spécifiés par la coutume, un conseil de fraisage positionnement stéréotaxique, permettant ainsi à des virus ou d&#39;autres réactifs pour être livré à l&#39;ensemble des régions du cerveau désirée. Pour utiliser l&#39;appareil, le chirurgien remplit d&#39;abord le sous-système fluidique entièrement avec de l&#39;huile, des remblais des capillaires avec le virus, insère le dispositif dans le cerveau, et infuse lentement réactifs (&lt;0,1 ul / min). Cette technologie permettra à une grande variété de nouveaux types d&#39;expériences, telles que milliseconde calendrier d&#39;arrêt de façon complexe en forme de structures (telles que l&#39;hippocampe) à des moments précis au cours de comportement, l&#39;inactivation temporellement précise des structures bilatérales qui peuvent agir de manière redondante (tels que l&#39;amygdale gauche et droite), et la perturbation de plusieurs régions cérébrales discrètes (par exemple, conduire deux régions reliées en opposition de phase pour étudier comment la Croix-région dépend de l&#39;activité synchronie dans chaque région, ou de stimuler les entrées d&#39;une région tout en taire un sous-ensemble de les cibles afin de comprendre lequel des plusieurs cibles sont essentielles pour la médiation des effets de ces entrées). Pour un grand cerveau comme celles chez le primate, dans lequel nous avons récemment démontré optiques de type cellulaire d&#39;activation spécifique de neurones 3, perturbant l&#39;activité dans une zone behaviorally pertinente peut exiger l&#39;étiquetage virale de grandes structures complexes. Nous notons que les tableaux parallèles injecteur peut être utilisé pour injecter près de toute charge utile - les médicaments, les neuromodulateurs, des neurotransmetteurs, ou même des cellules - en 3-D complexes schémas dans le cerveau, d&#39;une manière temporellement précis. Enfin, du point de vue de translation, il est possible que la rapidité, la thérapie génique patient personnalisés ou des dispositifs de délivrance de médicaments peuvent être rapidement personnalisés conçus et fabriqués pour correspondre à géométries cerveau individuel, en soutenant de nouveaux traitements pour une variété de pathologies, potentiellement grâce à l&#39;utilisation des molécules de contrôle optique. Les tableaux injecteurs sont conçus pour être précis, à la fois spatialement et volumétrique. Dans le X et Y-directions, ceci est accompli par le forage des trous placés de façon très précise en utilisant un moyen peu coûteux de mini-moulin, avec les trous juste assez grand pour accueillir les injecteurs, de sorte que les injecteurs sont tenues parallèlement les uns aux autres, et de manière précise emplacement. Dans la direction Z, les injecteurs sont coupés à l&#39;aide d&#39;un appareil de stéréotaxie, permettant un niveau de précision équivalente à celle de la chirurgie stéréotaxique lui-même. La précision volumétrique découle de la précision de la pompe à Hamilton, ainsi que les proches de zéro volume mort connecteurs, adapté de la chromatographie liquide à haute pression (CLHP) sur le terrain. Les injecteurs sont fabriqués à partir de tube capillaire en silice fondue, ce qui est solide et assez rigide qu&#39;il maintient la forme et un espacement précis sous pression, sans l&#39;épaisseur plus grande muraille de solutions de rechange telles que des canules en acier. De petites modifications peuvent facilement être faits pour adapter le réseau parallèle injecteur à une variété d&#39;expériences. Par exemple, si un plus petit volume de virus ou de l&#39;espacement plus fine est nécessaire, les petits tubes capillaires peuvent être employés, avec un peu plus petit foret correspondant. Les futurs appareils peuvent utiliser des canaux microfluidiques et des pompes, pour augmenter le nombre d&#39;injecteurs parallèlement, de minimiser la taille (peut-être permettant à ces dispositifs pour être montés sur la tête des animaux se déplacent librement).

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<tr>
<td>Hot glue gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Stanley Bostitch</td>
<td>GR20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump)</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton syringes</td>
<td>Tool</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>701N</td>
<td>Need one per injection site</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse stereotax</td>
<td>Tool</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51725D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Modela mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Roland</td>
<td>MDX-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.011" diameter drill bit for mini mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8915A12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/32" diameter drill bit For mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>8848A35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High speed dental drill</td>
<td>Tool</td>
<td>Lynx</td>
<td>333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dental drill accessories</td>
<td>Tool</td>
<td>Pearson</td>
<td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HTX-15R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 binding slotted machine screw</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>MX-0172B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 hex nut</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HNX-0172</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCB proto-board, 1/32" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Digi-Key</td>
<td>PC57-T-ND</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylic Sheet, 1/8" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8560K239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HPLC connectors</td>
<td>Material</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an &#x2018;x&#x2019; to the end of the part number)</td>
<td>Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused</td>
</tr>
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing, OD: 245 &mu;m, ID: 100 &mu;m</td>
<td>Material</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>2000022-10M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
<td>Material</td>
<td>Permatex</td>
<td>84101</td>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyethylene tubing .066 x .095 inch</td>
<td>Material</td>
<td>VWR</td>
<td>63018-827</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

scalable fluidic injector arrays for viral targeting of intact 3-d brain circuits

Notre compréhension des circuits neuronaux - comment ils arbitrer les calculs que cette sensation subserve, la pensée, l&#39;émotion et l&#39;action, et comment ils sont corrompus dans les troubles neurologiques et psychiatriques - serait grandement facilitée par une technologie de cibler rapidement les gènes de 3 complexes - dimensions circuits neuronaux, permettant la création rapide de &quot;niveau circuit transgéniques.&quot; Nous avons récemment développé des méthodes d&#39;encodage dans lequel des virus sensibles à la lumière des protéines peuvent sensibiliser les types de cellules spécifiques à la milliseconde-calendrier d&#39;activation et de réduire au silence dans le cerveau intact. Nous présentons ici la conception et la mise en œuvre d&#39;un tableau d&#39;injection capable de délivrer des virus (ou d&#39;autres liquides) à des dizaines de points définis au sein de la structure en 3 dimensions du cerveau (<strong&gt; Figure. 1A, 1B</strong&gt;). Le tableau injecteur comprend un ou plusieurs pompes volumétriques que chaque lecteur un ensemble de seringues, dont chacun se nourrit dans un verre de silice-polyimide / capillaire via un connecteur haute pression tolérant. Les capillaires sont de taille, puis inséré dans, endroits désirés spécifiés par la coutume, un conseil de fraisage positionnement stéréotaxique, permettant ainsi à des virus ou d&#39;autres réactifs pour être livré à l&#39;ensemble des régions du cerveau désirée. Pour utiliser l&#39;appareil, le chirurgien remplit d&#39;abord le sous-système fluidique entièrement avec de l&#39;huile, des remblais des capillaires avec le virus, insère le dispositif dans le cerveau, et infuse lentement réactifs (&lt;0,1 microlitres / min). La nature parallèle du tableau injecteur facilite l&#39;étiquetage rapide, précis et robuste de l&#39;ensemble des circuits neuronaux avec des charges virales comme sensibilisateurs optiques pour permettre à la lumière d&#39;activation et au silence des circuits cérébraux définis. Avec d&#39;autres technologies, telles que des tableaux de fibre optique pour la livraison de lumière à des ensembles souhaités de régions du cerveau, nous espérons créer une boîte à outils qui permet à la systématique de palpage de causalité fonctions neuronales dans le cerveau intact. Cette technologie peut non seulement ouvrir un tel approches systématiques au circuit axé sur les neurosciences chez les mammifères, et de faciliter l&#39;étiquetage des régions du cerveau chez les gros animaux comme les primates non-humains, mais peut aussi ouvrir une voie clinique translationnelle pour les cellules spécifiques des prothèses de contrôle optique , dont la précision peut permettre l&#39;amélioration du traitement des troubles du cerveau réfractaire. Enfin, des dispositifs tels que décrits ici peuvent faciliter justement au moment opportun la livraison fluidique d&#39;autres charges utiles, comme les cellules souches et les agents pharmacologiques, à 3 dimensions des structures, de manière facilement personnalisables par l&#39;utilisateur.

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Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Contrôle et analyse des circuits neuronaux<em&gt; In vivo</em&gt; Serait facilitée par une technologie pour la prestation des virus et autres réactifs pour désirée en 3 dimensions des ensembles de régions cérébrales. Nous démontrons la fabrication personnalisée fluidiques array injecteur, et la livraison de viro-codés sensibilisateurs optiques, permettant la manipulation optique des circuits cérébraux complexes.

Évolutif fluidique Arrays Injecteur pour virale ciblage d&#39;Intact circuits du cerveau en 3-D

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

scalable-fluidic-injector-arrays-for-viral-targeting-intact-3-d-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K vues.  Massachusetts Institute of Technology. Contrôle et analyse des circuits neuronaux In vivo Serait facilitée par une technologie pour la prestation des virus et autres réactifs pour désirée en 3 dimensions des ensembles de régions cérébrales. Nous démontrons la fabrication personnalisée fluidiques array injecteur, et la livraison de viro-codés sensibilisateurs optiques, permettant la manipulation optique des circuits cérébraux complexes.

Vidéo: Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

Ciblage des structures cérébrales profondes avec des microinjections de livraison des médicaments, des vecteurs viraux, ou de cellules

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Recherche

Neurosciences

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Intact Caractérisation histologique du cerveau Microdevices-implantées et les tissus environnants

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Enregistrement électrophysiologique dans le cerveau d&#39;Intact poisson zèbre adulte

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

Imagerie 3-D et de l&#39;analyse des neurones infecté<em&gt; In Vivo</em&gt; Avec<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Modification d&#39;un Colliculo-thalamocortical cerveau de souris Slice, Intégrer l&#39;impression 3-D de la Chambre des composants et multi-échelle imagerie optique

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogénétiques Dissection de circuits Peur en tranches cérébrales

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not represent the underlying cytoarchitectural and functional complexity of the affected individuals carrying suspected disease variants. Conventional 2-D models remain incomplete representations of in vivo-like structures and do not adequately capture the complexity of the brain. Thus, there is an emerging need for more 3-D hiPSC-based models that can better recapitulate the cellular interactions and functions seen in an in vivo system.
Here we report a protocol to develop a 3-D system from undifferentiated hiPSCs based on the serum free embryoid body (SFEB). This 3-D model mirrors aspects of a developing ventralized neocortex and allows for studies into functions integral to living neural cells and intact tissue such as migration, connectivity, communication, and maturation. Specifically, we demonstrate that the SFEBs using our protocol can be interrogated using physiologically relevant and high-content cell based assays such as calcium imaging, and multi-electrode array (MEA) recordings without cryosectioning. In the case of MEA recordings, we demonstrate that SFEBs increase both spike activity and network-level bursting activity during long-term culturing. This SFEB protocol provides a robust and scalable system for the study of developing network formation in a 3-D model that captures aspects of early cortical development.

Here we report a protocol to develop a three-dimensional (3-D) system from human induced-pluripotent stem cells (hiPSCs) called the serum free embryoid body (SFEB). This 3-D model can be used like an organotypic slice culture to model human cortical development and for the physiological interrogation of developing neural circuits.

Développer des corps embryoïdes libres de sérum dérivés dérivés de HiPSC pour l&#39;interrogation de cultures cellulaires souches 3-D à l&#39;aide de tests physiologiquement pertinents

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Alliant Optogenetics artificiel microARN pour caractériser les effets du gène Knockdown fonction présynaptique dans les Circuits de neurones intacts

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Génération d'hydrogels à base de collagène 3D pour analyser la croissance et le comportement axonal pendant le développement du système nerveux

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and smaller functional subgroups, it becomes paramount to record from projections and/or genetically-defined subpopulations of neurons. Fiber photometry is an accessible and powerful approach that can overcome these challenges. By combining optical and genetic methodologies, neural activity can be measured in deep brain structures by expressing genetically-encoded calcium indicators, which translate neural activity into an optical signal that can be easily measured. The current protocol details the components of a multi-fiber photometry system, how to access deep brain structures to deliver and collect light, a method to account for motion artifacts, and how to process and analyze fluorescent signals. The protocol details experimental considerations when performing single and dual color imaging, from either single or multiple implanted optic fibers.

This protocol details how to implement and perform multi-fiber photometry recordings, how to correct for calcium-independent artifacts, and important considerations for dual-color photometry imaging.

Photométrie multifibres pour enregistrer l'activité neuronale chez les animaux en mouvement libre

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...