This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).

Les procédures expérimentales ont été approuvés par le comité de l&#39;Université Thomas Jefferson de protection des animaux et de l&#39;utilisation et menées en conformité avec la directive Communautés européennes Conseil (2010/63 / UE, 86/609 / CEE et 87-848 / CEE), le NIH Guide pour la les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire, et la Société pour les politiques de Neuroscience sur l&#39;utilisation d&#39;animaux dans la recherche en neurosciences. 1. Les potentiels d&#39;action composé de Muscle (CMAP) <ol><li> Préparation de l&#39;animal: <ol><li> Anesthésier le rat en utilisant un inhalant (isoflurane) à 1-2% livrés à effet ou par injection (kétamine, xylazine, acépromazine). Dosage de l&#39;anesthésie injectable est la suivante: 95,0 mg / kg de kétamine, 10,0 mg / kg de xylazine, 0,075 mg / kg de l&#39;acépromazine. NOTE: Nous utilisons avec succès à la fois inhalées et anesthésique injectable approches lors de la conduite de ce protocole d&#39;enregistrement CMAP, sans préférence. </li><li> L&#39;animal doit être maintenue à l&#39;une appropriéenesthetic profondeur avant la chirurgie est commencé, grâce à la conclusion de la chirurgie, et jusqu&#39;à ce que la buprénorphine post-opératoire a pris effet. Confirmez anesthésie appropriée par un bref pincement de l&#39;orteil pour déterminer qu&#39;une réponse de retrait n&#39;a pas suscité. En outre, de tester le réflexe cornéen avec un coton-tige. Tout au long de la procédure chirurgicale, déterminer que la fréquence cardiaque et la fréquence respiratoire ont pas augmenté, ce qui suggère que profondeur de l&#39;anesthésie est devenue trop léger. </li><li> Appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux de l&#39;animal pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie. </li><li> Le chirurgien doit la laver / ses mains avec un désinfectant (chlorhexidine gommage) avant de commencer la chirurgie. Le chirurgien doit porter des gants stériles, masque et blouse ou un sarrau propre. Tous les instruments doivent être lavés et stérilisés à l&#39;autoclave avant la chirurgie. Ajouter une bande d&#39;indicateur de stérilisation à l&#39;intérieur du kit de bord avant passage à l&#39;autoclave, au niveau des instruments pour vérifier que la stérilisation est terminée. Le chirurgien doitvérifiez que l&#39;ensemble de la ligne sur la bande est noir avant de commencer la chirurgie. Collez l&#39;extérieur de la boîte avec du ruban autoclave indiquant ainsi. Si la chirurgie doit être réalisée sur plusieurs animaux le jour même, le nettoyage des instruments entre les chirurgies et stériliser dans un stérilisateur à billes de verre. Si nécessaire, stériliser les deux extrémités de l&#39;instrument dans le stérilisateur à billes de verre en plaçant la poignée de l&#39;instrument dans le stérilisateur pendant le temps approprié, la suppression de l&#39;instrument avec une pince hémostatique stérile, en le refroidissant dans un champ stérile, puis en plaçant l&#39;extrémité fonctionnelle de l&#39;instrument dans le stérilisateur à billes de verre pour la période de temps appropriée. </li><li> Une fois que l&#39;animal est anesthésié, lieu à bord chirurgicale avec la surface dorsale vers le bas et vers le haut de l&#39;abdomen de sorte que la bande peut être utilisé pour sécuriser les pattes avant de l&#39;animal à bord chirurgicale. </li><li> Rasez ventrale caudale de la surface à partir de la base du crâne, et veiller à ce que la zone autour de l&#39;abdomen de chaque côté de la ligne médiane est shAved selon hémi-diaphragme qui est en cours d&#39;enregistrement. Appliquer la povidone-iode à la surface rasée de la peau. </li></ol></li><li> Préparation pour les enregistrements CMAP: <ol><li> Après la préparation des animaux, placer l&#39;électrode de terre sous-cutanée dans la queue (Figure 1). </li><li> Placez la voie sous-cutanée de l&#39;électrode de référence dans la région inférieure de l&#39;abdomen controlatéral. </li><li> Placez gel conducteur sur la bande de surface auto-adhésive ou électrode d&#39;enregistrement de disque (dimensions de surface électrode en bande: 0,5 x 3 cm), puis placer l&#39;électrode de surface transversalement le long du rebord costal unilatérale. </li><li> Placez électrodes de stimulation transcutanée 0,5 cm en dehors de la trachée et latérales supérieures à la clavicule. Insérer les électrodes d&#39;environ 1,0 cm de profondeur à travers la peau. Fixez les électrodes à la main de sorte que leur emplacement ne se déplace pas avec stimulations ultérieures. NOTE: Angle électrodes 90 ° par rapport à la peau au niveau du site de stimulation insertion. </li></ol></li><li> Composé Muscle potentiel d&#39;action (CMAP) Enregistrements: <ol><li> Obtenir des enregistrements électrophysiologiques en utilisant un stimulateur / amplificateur suivi d&#39;analyse assistée par ordinateur des données. </li><li> Les paramètres de stimulation de stimulation de traction unique devraient être de 0,5 ms, 1,0 Hz impulsions supramaximales. L&#39;amplitude du stimulus doit être compris entre 6,0 et 8,0 V (figure 2A). REMARQUE: Dans une expérience, en utilisant une intensité de stimulation avec la même amplitude sur les animaux. L&#39;objectif est de maximiser l&#39;amplitude de la réponse à l&#39;aide de l&#39;amplitude minimale de stimulation. Il est important de noter que la réaction initiale qui se produit au moment de la stimulation est un artefact de stimulation. En outre, il faut prendre soin d&#39;obtenir une réponse CMAP qui est précédé par une ligne de base stable / plat après l&#39;artefact de stimulation, qui est ensuite suivie par la réponse rapide CMAP. Afin d&#39;obtenir une telle réponse, il peut être nécessaire de repositionner la stimulation et / oudes électrodes d&#39;enregistrement. </li><li> Attendre 30 secondes entre les stimulations, et répétez 10 stimulations dans une rangée pour obtenir la réponse moyenne (Figure 2B - C). Mesurer l&#39;amplitude du départ à la crête (figure 2A). Mener la stimulation du nerf phrénique pendant la phase de cycle respiratoire de l&#39;animal lorsque le nerf phrénique / diaphragme est pas activé. La procédure peut être répétée sur le même animal pour l&#39;hémi-diaphragme controlatéral. </li><li> Après la dernière session d&#39;enregistrement de CMAP, perfuser l&#39;animal si NMJ coloration sera réalisée. Effectuer enregistrements CMAP à plusieurs reprises sur le même animal environ une fois par semaine (ou à intervalle de choix). </li><li> Après survie enregistrements CMAP, permet animal à récupérer sur un coussin chauffant de l&#39;eau chaude circulant et surveillent continuellement lors de la récupération jusqu&#39;à couché éveillé et sternally. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d&#39;autres animaux jusqu&#39;à guérison complète. &lt;/ Li&gt; <li> Une fois sternally couché, surveiller l&#39;animal toutes les 12 heures pendant les 48 premières heures (une fois par jour par la suite). Si l&#39;animal semble être déshydraté (peau flasque, apathie), administrer des fluides (solution de sonneurs lactate; sous-cutanée; 1-2 ml par injection, avec les sites rotation; 2 fois par jour) jusqu&#39;à poids post-chirurgicale et de la perte de liquide stabilise. Fournir des animaux avec de la nourriture ramollie dans de petits plats durant la période post-opératoire aiguë si nécessaire pour encourager manger si elles ne peuvent pas atteindre le chargeur fil barre de couvercle. </li><li> Administrer la buprénorphine à une dose de 0,05 mg / kg avant la fin de la chirurgie, puis à intervalles de 12 h pour les 24 premières heures (et dépend des signes de douleur / le stress par la suite) par injection sous-cutanée (site de rotation). Si des signes de douleur ou de détresse sont remarqués par la suite, traiter les animaux avec la buprénorphine. Signes distinctifs de la douleur / détresse comprennent le manque d&#39;activité, vocalisations, absence de manger ou de boire (déshydratation), perte de poids excessive, gardiennage, excessif rongeant ou en grattant site d&#39;incision. Des critères supplémentaires utilisées dans la détermination de la douleur et de la détresse comprennent l&#39;absence de réponse à des stimuli externes, la vocalisation transitoire ou non provoquée, respiration laborieuse ou anormale, décharge naso-oculaire brun rougeâtre persistante, horripilation marquée. Surveiller également des preuves d&#39;une mauvaise hygiène qui suggérerait animaux malades. Si l&#39;animal est toujours observée en détresse après 72 heures de traitement (selon les critères douleur / de stress décrire ci-dessus, et après avoir reçu le protocole analgésique décrit ci-dessus) euthanasier l&#39;animal. </li></ol></li></ol> 2. Diaphragme jonction neuromusculaire (JNM) Analyse <ol><li> Dissection des animaux: <ol><li> Administrer l&#39;animal une surdose de l&#39;anesthésie injectable (3 fois la dose utilisés ci-dessus: la kétamine à 285,0 mg / kg, xylazine à 30,0 mg / kg, l&#39;acépromazine à 0,225 mg / kg; administré par voie intrapéritonéale). Après un surdosage, tous les animaux devraient avoir une deuxième méthode d&#39;euthanasie (thoracotomie) to garantir la mort. Mort devrait être confirmée par l&#39;observation de l&#39;arrêt cardiaque et respiratoire et en notant les pupilles fixes et dilatées de l&#39;animal. </li><li> Mener une laparotomie avec scalpel ou des ciseaux de dissection étendant l&#39;excision du processus zyphoid caudale le long de la ligne médiane. Soigneusement séparer la peau et du tissu conjonctif du muscle sous-jacent en utilisant scalpel et pince. </li><li> En tirant sur le processus zyphoid, utiliser des ciseaux de dissection pour enlever toute la membrane, veiller à ce que la membrane reste attaché à l&#39;os environnant. Ceci est important car elle permet d&#39;éviter d&#39;endommager le muscle du diaphragme, permettra pour la dissection succès de l&#39;ensemble du diaphragme et aidera dans le muscle de nettoyage pour coloration subséquente. NOTE: A ce stade, l&#39;animal peut être perfusé si nécessaire. </li></ol></li><li> Nettoyage et coloration de la membrane: <ol><li> Cerner l&#39;ensemble disséqué diaphragme, la surface supérieure vers le haut, au caoutchouc de silicone dans un verre plat de 100 mm Petri dansParaformaldéhyde 4% (en fait 1% de phosphate saline tamponnée - PBS) pendant 20 min en utilisant un stéréomicroscope. Étirez le diaphragme pour le rendre tendu, et en utilisant des épingles insectes, épingler le tissu environnant pour éviter épinglant le diaphragme muscle lui-même (Figure 3). </li><li> Nettoyer délicatement le tissu conjonctif à partir de seulement la surface supérieure du muscle avec # 5 forceps et de petits ciseaux. REMARQUE: Effectuer toutes les étapes ultérieures de ce protocole de coloration bascule lentement à température ambiante couvert de la lumière, sauf indication contraire. Assurez-vous que le muscle du diaphragme est toujours complètement immergé dans un liquide pour éviter le dessèchement. </li><li> Avant la coloration, préparer tous les réactifs nécessaires: 1x PBS, 2% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) / PBS, 0,1 M de glycine réalisés dans 2% de BSA / PBS, 4% de paraformaldehyde (PFA) dans 1 x PBS et 0,2% de phosphate de tributyle (0,2 % de Triton X100 à 2% de BSA / PBS). Soyez sûr d&#39;effectuer une pré-cool méthanol à -20 ° C. </li><li> Laver 3x pendant 10 minutes dans du PBS 1x. </li><li> Incuber dans 0,1 M de glycine (fait en 2% De BSA / PBS) pendant 30 min. </li><li> Incuber dans RBTX (rhodamine conjugué α-bungarotoxine) solution pendant 15 min. Solution pour RBTX est le suivant: alpha-bungarotoxine Rhodamine conjugué 1: 400 dilution en PBS 1x. REMARQUE: Dans ce protocole, la rhodamine est utilisé, mais n&#39;importe quel fluorophore de choix peut être utilisée pour la coloration. </li><li> Laver 3x pendant 10 minutes dans du PBS 1x. </li><li> Dans congélateur à -20 ° C, incuber avec du MeOH pendant 5 min. NOTE: Ne pas ajouter MeOH avant de placer musculaire dans le congélateur, et retirer immédiatement solution suivante de la période d&#39;incubation. </li><li> Laver 3x pendant 10 minutes dans du PBS 1x. </li><li> Bloquer dans 0,2% TBP pendant 1 heure (0,2% de Triton faite dans 2% de BSA / PBS). </li><li> Incuber avec une solution d&#39;anticorps primaire (dans 0,2% de TBP) à 4 ° C pendant une nuit tout en balançant. Dilutions d&#39;anticorps comme suit: SV2 (1:10) et SMI-312 (1: 1000). </li><li> Laver 3x pendant 10 minutes avec 0,2% de TBP. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps secondaire à l&#39;aide dilution 1: 100 de FGM1 (chèvre conjugué à FITC anti-souris IgG1; faite dans 0,2% TBP) en basculant pendant 1 heure. REMARQUE: Protéger de la lumière pour le reste du protocole pour la coloration. </li><li> Laver 3x pendant 10 minutes avec PBS 1x. </li><li> Re-propre tissu conjonctif environnant sur le supérieur (voir ci-dessus) la surface du muscle avant le montage et lamelles. NOTE: Il est recommandé de nettoyer puis monter l&#39;échantillon immédiatement après la coloration. Cependant, si nécessaire, l&#39;échantillon peut être couverte en PBS 1x, enveloppé dans du parafilm pour éviter l&#39;évaporation et stockée à 4 ° C pendant 1 semaine, avec changement de PBS par jour. </li><li> Lors du montage sur lame de verre, lamelle avec les non-hardset Vectashield. Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles transparent pour éviter le dessèchement. Stocker les lames couchées dans des dossiers de diapositives en carton à -20 ° C pour le long terme. </li></ol></li><li> Analyse et imagerie confocale: <ol><li> Analyser quantitativement la morphologie de la teinté et monté hémidiaphragme sous 20X et 40X en utilisant une épifluorescence deboutmicroscope. NOTE: Parce que la membrane est colorée et analysé en tout-monter un mode, le muscle est assez épais. Par conséquent, plus de la coloration de fluorescence est complètement hors de mise au point lorsqu&#39;une image statique est prise en utilisant la microscopie de fluorescence non-confocale. Pour cette raison, il est préférable de procéder à l&#39;analyse NMJ en temps réel sur le microscope, car cela permet de vous concentrer constamment «haut» et «bas» à travers le muscle de bien identifier la morphologie de chacun des NMJs individuels. En utilisant cette approche, on peut facilement suivre la trajectoire des axones moteurs individuels comme ils se déplacent à travers le tissu en relation spatiale avec les amas de récepteurs post-synaptiques. </li><li> En mesurant la longueur ventrale-à-dorsale du muscle, il faut diviser le muscle en 3 sections distinctes pour les analyses fondées sur des motifs d&#39;innervation topographiques de niveaux spécifiques de la moelle épinière (Figure 4H). </li><li> Commençant à la région ventrale du muscle et moving dorsale, analyser toutes en NMJs visage situés sur les fibres musculaires de surface. Ne pas analyser fibres musculaires plus profondes que les 3-4 premières fibres de la surface comme l&#39;interprétation peut être difficile en raison de moins bonne pénétration des anticorps (RBTX pénètre plus profondément dans le muscle en raison de la petite taille de la toxine par rapport aux grandes anticorps utilisés pour marquer les neurones). </li><li> Identifier chaque NMJ comme intacte si l&#39;axone pré-terminale du neurone est épaisse de diamètre et de toutes les régions de la terminaison nerveuse chevauchent complètement avec les récepteurs de l&#39;acétylcholine des muscles sous-jacents (CCRS). </li><li> Identifier chaque NMJ comme partiellement dénervé si aucune région des AChR musculaires sous-jacents est inoccupé avec terminaison nerveuse correspondant. </li><li> Identifier chaque NMJ aussi complètement dénervé si les AChR musculaires avoir aucune terminaison nerveuse correspondant (il est également important d&#39;avoir d&#39;autres NMJs avec neurones marqués dans le même domaine de concentration, de sorte que l&#39;on peut être sûr que le manque de terminaison nerveuse est pas simplement due à cacar de pénétration des anticorps dans cette région du muscle). </li><li> Identifier chaque NMJ que se multiplient innervé si il ya plus d&#39;un pré-terminale axone innervant un NMJ individu (ce qui indique qu&#39;il ya eu un certain niveau de dénervation et les tentatives probables de réinnervation à cette jonction). </li><li> Identifier chaque NMJ aussi finement innervés si le NMJ a chevauchement complet entre la borne de nerf et AChR sous-jacents, mais a un axone pré-terminale mince (ce qui est aussi révélatrice d&#39;un certain niveau de dénervation et tentatives de réinnervation). </li><li> Effectuer une analyse pour chacune des trois régions identifiées pour toutes les catégories NMJ ci-dessus pour chaque animal. La moyenne des données de chaque animal avec les résultats des autres animaux du même groupe expérimental. Environ 200-300 jonctions chez le rat hémi-muscle du diaphragme et 150-200 chez la souris hémidiaphragme devraient être quantifiés dans au moins 3 (de préférence 5-6 ou plus) animaux par groupe expérimental. </li><li> Obtenir des images haute résolution confocale, l&#39;utilisationd pour publication, avec un microscope confocal. </li><li> Obtenir Z piles à 0,3 um de taille de pas de 20 à 40 um profondeurs, et recueillir sections optiques supplémentaires au-dessus et en dessous de chaque jonction de sorte que l&#39;ensemble du profil synaptique est inclus. </li><li> Utilisez le logiciel d&#39;acquisition pour reconstruire des images de la série Z dans les projections d&#39;intensité maximale. </li></ol></li></ol>

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Nous avons rien à révéler.

Comme la fonction respiratoire est compromise à la fois SCI traumatique et la SLA, le développement de thérapies qui ciblent spécifiquement la respiration et l&#39;innervation diaphragme sont cliniquement significatives 5,6. Afin d&#39;étudier globalement la fonction respiratoire, une méthode d&#39;approche combinée devrait être utilisé. CMAP mesurent le degré d&#39;innervation fonctionnelle de la membrane par le biais de la stimulation du nerf phrénique externe, mais la commande respiratoire bulbo...

La sclérose latérale amyotrophique (ALS) est une maladie débilitante des neurones moteurs associés à la perte des deux neurones moteurs supérieurs et inférieurs et en conséquence une paralysie musculaire. Lors du diagnostic, la survie des patients est en moyenne de seulement 2-5 ans 1. Phrénique motoneurone (PhMN) la perte est une composante essentielle de la pathogenèse de la SLA. Les patients finissent par mourir à cause de la perte de PhMN innervation du diaphragme, le muscle principal de l&#39;inspiration 2,3. Traumatisme de la moelle épinière (SCI) est également un sérieux problème avec des difficultés respiratoires associés. Environ 12 000 nouveaux cas de SCI se produisent chaque année 4 en raison de dommages traumatiques de la moelle épinière. Malgré l&#39;hétérogénéité de la maladie par rapport à l&#39;emplacement, le type et la gravité, la majorité des cas SCI implique un traumatisme à la moelle épinière cervicale, ce qui se traduit souvent par une insuffisance respiratoire invalidante et persistante. En plus de la SLA et SCI, autre système nerveux central (SNC) peut être associée wdysfonctionnement respiratoire diaphragmatique vec 5,6. Le nerf phrénique est un nerf moteur efférent qui innerve l&#39;hémi-diaphragme ipsilatéral et qui provient de corps cellulaires PhMN situés dans les niveaux C3-C5 de la moelle épinière cervicale homolatérale. PhMN sortie est contrôlé par décroissant entrée bulbospinal du tronc cérébral dans une zone connue sous le nom du groupe rostrale ventrale respiratoire (rVRG) 7. Le circuit rVRG-PhMN diaphragme est au cœur du contrôle de la respiration inspiratoire, ainsi que d&#39;autres comportements à membrane non-ventilatoires. Diverses blessures traumatiques et des troubles neurodégénératifs qui affectent ces circuits peuvent conduire à une baisse profonde de la fonction respiratoire et la qualité de vie des patients. Décroissant entrée PhMNs de la survie rVRG, PhMN, l&#39;intégrité du nerf phrénique et l&#39;innervation correcte à la jonction neuromusculaire diaphragme (NMJ) sont tous nécessaires pour le fonctionnement de la membrane normale. Il est donc important d&#39;utiliser des techniques quipeut évaluer quantitativement ce circuit in vivo dans des modèles de rongeurs de la SLA, SCI et d&#39;autres maladies du SNC. Avec ce protocole, l&#39;objectif est de décrire les outils expérimentaux pour évaluer PhMN innervation du diaphragme à la fois au niveau électrophysiologiques et morphologiques. Composé potentiels d&#39;action musculaire (CMAP) sont enregistrées en stimulant tous les axones moteur efférent de neurones d&#39;un nerf moteur donnée, puis analyser la réponse de dépolarisation élicite des myofibres cibles. Cette technique peut être utilisée in vivo chez des rats et des souris anesthésiées à quantifier innervation fonctionnelle de l&#39;hémi-diaphragme par PhMNs 8. En raison du fait que CMAP représentent enregistrement simultané de tous (ou au moins beaucoup de / la plupart) myofibres de l&#39;ensemble de l&#39;hémi-diaphragme, il est utile d&#39;examiner également les phénotypes des axones et myofibres automobiles individuels au NMJ de diaphragme afin de suivre la maladie - et des changements morphologiques thérapie pertinentes telles que partielle et complete dénervation, germination régénérative et réinnervation. Ceci peut être accompli via l&#39;ensemble du support immunohistochimie (IHC) de la membrane, suivie d&#39;une évaluation morphologique de NMJs individuels à travers le muscle 9. Combinant CMAP et l&#39;analyse NMJ offre une approche puissante pour étudier quantitativement innervation diaphragmatique dans des modèles rongeurs de la maladie SNC et du SNP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:273px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">T353-500</td>
			<td style="width:167px;">Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:273px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">2% Bovine serum albumin (2% BSA)</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A3059-100g</td>
			<td>Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer)</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">T9284-100mL</td>
			<td>Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.1M Glycine</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G-7126</td>
			<td>Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">&#945;-bungarotoxin</td>
			<td style="width:273px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">T1175</td>
			<td>Concentration 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SMI-312&#160;</td>
			<td style="width:273px;">Sternberger Monoclonals</td>
			<td style="width:131px;">SMI312</td>
			<td>Concentration 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SV2</td>
			<td style="width:273px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:131px;">SV2-Supernatant</td>
			<td>Concentration 1:10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">FITC goat anti-mouse IgG1</td>
			<td style="width:273px;">Roche</td>
			<td style="width:131px;">3117731001</td>
			<td>Concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Silicone rubber</td>
			<td style="width:273px;">Sylgard, Dow Corning</td>
			<td style="width:131px;">Part # 184</td>
			<td>Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Vectashield fluorescent mounting medium</td>
			<td style="width:273px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:131px;">H-1000</td>
			<td>This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Small Spring Scissors</td>
			<td style="width:273px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">15002-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Dissection forceps</td>
			<td style="width:273px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Software for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">Scope 3.5.6; ADI</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Disk surface electrodes</td>
			<td style="width:273px;">Natus neurology</td>
			<td style="width:131px;">019-409000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Subdermal needle electrodes</td>
			<td style="width:273px;">Natus neurology</td>
			<td style="width:131px;">019-453100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Conductive gel</td>
			<td style="width:273px;">Aquasonic&#160;</td>
			<td style="width:131px;">122-73720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:332px;">Stimulator/recording system for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">ADI Powerlab 8SP stimulator&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Amplifier for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">BioAMP</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional and morphological assessment of diaphragm innervation by phrenic motor neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Adulte rats Sprague-Dawley ont reçu soit une laminectomie seulement (contrôle indemne) ou unilatérale hémi-SCI contusion au niveau de la moelle épinière C4 10-12. A 5 semaines après la chirurgie, le pic CMAP amplitude enregistrée à partir de l&#39;hémi-diaphragme ipsilatérale au site laminectomie / blessures a été significativement réduite chez les rats SCI (figure 2C) par rapport à laminectomie seule commande (figure 2B). Tous NMJs dans l&#39;hémi-diaphragme ...

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Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Évaluation fonctionnelle et morphologique de membrane innervation par phrénique motoneurones

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

functional-morphological-assessment-diaphragm-innervation-phrenic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.4K vues.  Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University. Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease. 

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Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Physiologiques, caractérisation morphologique et neurochimiques des neurones modulée par le Mouvement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Recherche

Neurosciences

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Etiquetage des neurones ciblés dans une fonction spécifique à micro-domaine du néocortex par combinaison du signal intrinsèque et à deux photons d&#39;imagerie

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Identifier les motoneurones extracellulaire d&#39;un Motor Pool musculaire dans<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

Traçage neuroanatomique rétrograde des motoneurones phréniques chez la souris

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

Évaluation morphologique et fonctionnelle des synapses de ruban aux régions spécifiques de fréquence de la Cochlea de souris

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Conversion de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs) en neurones moteurs spinaux et crânien fonctionnels utilisant des vecteurs PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Analyse cinématique 3D pour l’évaluation fonctionnelle dans le modèle de rat de la blessure d’écrasement de nerf sciatique

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

Évaluation morphologique et fonctionnelle des axones et de leurs Synapses pendant la mort d’Axon dans Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study axonal growth, axonal trafficking, synaptogenesis, dendritic growth, dendritic plasticity and nerve-target interactions in co-culture systems. This protocol describes the isolation and dissociation of neurons from the superior cervical ganglia of E21 rat embryos, followed by the preparation and maintenance of pure neuronal cultures in serum-free medium. Since neurons do not adhere to uncoated plastic, neurons will be cultured on either 12 mm glass coverslips or 6-well plates coated with poly-D-lysine. Following treatment with an antimitotic agent (Ara-C, cytosine &#946;-D-arabinofuranoside), this protocol generates healthy neuronal cultures with less than 5% non-neuronal cells, which can be maintained for over a month in vitro. Although embryonic rat SCG neurons are multipolar with 5-8 dendrites in vivo; under serum-free conditions, these neurons extend only a single axon in culture and continue to be unipolar for the duration of the culture. However, these neurons can be induced to extend dendrites in the presence of basement membrane extract, bone morphogenetic proteins (BMPs), or 10% fetal calf serum. These homogenous neuronal cultures can be used for immunocytochemical staining and for biochemical studies. This paper also describes optimized protocol for immunocytochemical staining for microtubule associated protein-2 (MAP-2) in these neurons and for the preparation of neuronal extracts for mass spectrometry.

This paper describes the isolation and culturing of embryonic rat sympathetic neurons from the superior cervical ganglia. It also provides detailed protocols for immunocytochemical staining and for preparing neuronal extracts for mass spectrometric analysis.

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonate Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in hindlimb muscles (such as the medial gastrocnemius, soleus, or plantaris muscle) in experimental rats. A crucial element of the method is the application of electrical stimuli delivered to a motor axon isolated from the ventral root. The stimuli may be delivered at constant or variable inter-pulse intervals. This method is suitable for experiments on animals at varying stages of maturity (young, adult or old). Moreover, this protocol can be used in experiments studying variability and plasticity of motor units evoked by a large spectrum of interventions. The results of these experiments may both augment basic knowledge in muscle physiology and be translated into practical applications. This procedure focuses on the surgical preparation for the recording and stimulation of MUs, with an emphasis on the necessary steps to achieve preparation stability and reproducibility of results.

This method allows the recording of the force of twitch and tetanic contractions and action potentials in three types of motor units in the rat medial gastrocnemius muscle. The functional isolation of a single motor unit is induced by electrical stimulation of the axon.

Isolement fonctionnel des unités motrices individuelles du muscle gastrocnemius de Rat Medial

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...