Cette méthode vise à démontrer une technique simple d’extraction de protéines, utile pour l’obtention de protéines abondantes et d’autres facteurs. Cette technique pourrait être utilisée pour extraire d’autres facteurs et protéines présents dans la membrane amniotique et aussi, pour obtenir des protéines d’autres sources telles que les animaux et les tissus végétaux. Commencez par décongeler 100 milligrammes de la membrane amniotique obtenue à partir de la banque d’amnions.
Une fois décongelé, ajoutez 10 millilitres de la solution saline équilibrée stérile à une boîte de Petri et lavez la membrane pendant deux minutes. Ensuite, retirez la solution saline équilibrée utilisée dans un bécher et répétez le processus jusqu’à ce qu’aucune trace de glycérol ne soit visible dans la boîte de Pétri. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de dispase II à la membrane et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 30 minutes.
À la fin de l’incubation, effectuer une désépithélialisation mécanique avec un grattoir de cellule de policier en caoutchouc. Ensuite, visualisez la membrane au microscope inversé pour confirmer la dé-épithélialisation. Ensuite, lavez la membrane amniotique désépithélialisée avec la solution saline équilibrée stérile comme démontré précédemment, et placez-la dans un tube microcentrifuge de deux millilitres.
Ensuite, immergez le tube contenant la membrane dans de l’azote liquide pendant 40 minutes. Après la congélation avec de l’azote liquide, broyer manuellement la membrane pendant deux à trois minutes dans un mortier, pré-refroidi à moins 85 degrés Celsius, jusqu’à l’obtention d’une poudre fine. Ensuite, ajoutez 2,5 millilitres de solution inhibitrice de protéase et solubilisez la membrane finement réduite.
Nettoyez les murs de mortier à l’aide d’un couteau à scalpel et transférez le mélange dans un tube de cinq millilitres. Tourbillonner le tube pendant 30 secondes. Ensuite, homogénéiser le mélange tissulaire en centrifugeant d’abord à 34 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, puis en le centrifugeant immédiatement à nouveau à 3, 360 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.
À la fin de la centrifugation, recueillir le surnageant, qui est l’extrait de membrane amniotique, dans un nouveau tube. Ensuite, aliquote 0,7 millilitre dans un tube microcentrifuge différent de deux millilitres pour différents points de temps et températures. La quantité totale de protéines et la concentration de lumican dans l’extrait de membrane amniotique ont été affectées par le temps et les conditions de stockage.
La concentration de protéines basales était similaire parmi tous les extraits de membrane amniotique. Cependant, une concentration significativement élevée de protéines a été notée dans l’extrait stocké pendant 32 jours à quatre degrés Celsius et 20 jours à moins 20 degrés Celsius. Le lumican dans l’extrait de membrane amniotique était significativement plus élevé dans l’échantillon stocké pendant une période de 12 jours par rapport aux échantillons stockés pendant 30, 20 et six jours à quatre et moins 20 degrés Celsius.
Ces résultats suggèrent que la durée et la température d’entreposage appropriées pour atteindre la concentration la plus élevée de lumican sont de 12 jours à moins 20 degrés Celsius. Faites preuve du plus grand soin lors de la mise à la terre de la membrane amniotique gelée. La mise à la terre doit être douce car elle pourrait tomber du mortier.
D’autres études sont nécessaires pour déterminer le rôle de l’extrait membranaire amniotique de lumican dans les cellules épithéliales cornéennes et pour déterminer la dose idéale de lumican pour la réépithélialisation cornéenne.
