Le volume élevé d’informations biologiques obtenues à partir de l’analyse d’images de codes à barres multiplex permet aux scientifiques de mieux comprendre le microenvironnement tumoral et la distribution spéciale dans les cellules tumorales. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle nous donne des informations beaucoup plus détaillées à partir du même échantillon de tissu avec la possibilité de faire un phénotypage plus profond de cellules individuelles. Cette méthode a permis à des panels personnalisables d’étudier le microenvironnement tumoral afin de découvrir potentiellement un biomarqueur prédictif dans les tissus cancéreux à utiliser comme nouveau traitement cible.
Pour commencer la coloration des anticorps conjugués oligonucléotidiques, tremper les bordereaux de couverture dans une solution de Poly-L-Lysine à 0,1% pendant 24 heures, à température ambiante pour les préparer à la mise en place et à l’adhérence des tissus. Après avoir vidangé la solution de Poly-L-Lysine, lavez les couvercles à l’eau ultrapure pendant 30 secondes. Après le lavage, retirez les couvercles de l’eau ultrapure et placez-les sur une serviette non pelucheuse pour sécher pendant la nuit.
Placez des sections de 5 microns d’épaisseur du tissu d’intérêt au centre d’une glissière de couverture chargée de poly-L-lysine et laissez-les sécher pendant la nuit. Préchauffez un porte-couvercle dans un four à 60 degrés Celsius, pendant la nuit. Placez le couvercle contenant des sections de tissu dans le support préchauffé.
Après l’avoir cuit à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes, vérifiez que la paraffine a fondu loin du tissu. Placez rapidement le porte-feuillet contenant l’échantillon séquentiellement, dans une série de solutions. Enfin, placez le porte-couvercle dans de l’eau ultrapure traitée DEPC pendant deux tours de cinq minutes chacun.
Préparez une chambre d’humidité en plaçant une serviette en papier imbibée d’eau au fond d’une boîte de pointe de pipette vide. Remplissez un autocuiseur avec de l’eau, assez pour couvrir la moitié de la hauteur d’un bécher de 50 millilitres. Placez 5 millilitres de méthanol par échantillon dans un bécher à 4 degrés Celsius.
Diluer le volume requis de tampon AR9 à 1X avec du pyrocarbonate de diéthyle ou de l’eau ultrapure traitée par DEPC. Ensuite, remplissez un bécher en verre de 50 millilitres avec environ 40 millilitres du tampon AR9 dilué. Immergez l’échantillon dans le porte-slip de couvercle dans le bécher et couvrez complètement le bécher avec du papier d’aluminium.
Placez le bécher recouvert de papier d’aluminium dans l’autocuiseur rempli d’eau et faites cuire à environ 15 PSI pendant 20 minutes. Ensuite, retirez le bécher et déballez soigneusement le papier d’aluminium. Laissez le bécher refroidir à température ambiante pendant environ 10 minutes.
Retirez le support de couvercle de la mémoire tampon AR9 1X. Incuber deux fois dans de l’eau ultrapure traitée DEPC pendant deux minutes. Pendant ce temps, récupérez le tampon d’hydratation, le diluant d’anticorps et les solutions de blocage N, G, J et S du kit de coloration d’imagerie multiplexé.
Placez l’échantillon de bordereau de couverture dans 5 millilitres du tampon d’hydratation deux fois, pendant deux minutes chacun. Placez ensuite l’échantillon de bordereau de couverture dans 5 millilitres du bloc de diluant d’anticorps d’imagerie multiplexé et incuber pendant 20 à 30 minutes à température ambiante. Pendant l’incubation, préparez le cocktail d’anticorps.
Après l’incubation, placez le couvercle dans la chambre d’humidité préalablement préparée. Pipeter 190 microlitres du cocktail d’anticorps sur l’échantillon de bordereau de couvercle et incuber à température ambiante pendant trois heures. Ensuite, lavez l’échantillon deux fois, chacun avec 5 millilitres du bloc de diluant d’anticorps d’imagerie multiplexé pendant deux minutes.
Pour fixer les anticorps liés au tissu, incuber les lamelles de couvercle pendant 10 minutes dans 16% de formaldéhyde dilué à 1,6% avec une solution de stockage, et les laver trois fois avec du PBS. Après avoir incubé le couvercle glisse pendant cinq minutes dans du méthanol, pré-refroidir à 4 degrés Celsius. Après le lavage, incuber à nouveau les feuillets de couvercle pendant 20 minutes, dans 5 millilitres du réactif fixateur dilué avec du PBS, et les laver trois fois avec du PBS avant de les stocker.
Préparez le master mix reporter en suivant la composition mentionnée dans le texte. Remplir un puits dans une plaque de 96 puits avec 245 microlitres d’une solution contenant le mélange principal rapporteur et les fluorophores à code-barres spécifiques pour ce cycle expérimental. La figure montre une configuration de plaque rapporteur utilisée ici pour un panneau de carcinome.
Pour protéger les fluorophores à code-barres, collez un couvercle de plaque en aluminium sur la plaque rapporteur à 96 puits et placez la plaque dans l’instrument d’imagerie multiplexé. Calibrez la focalisation de l’imagerie à l’aide du canal DAPI en plaçant un couvercle d’échantillon sur la platine du microscope et en pipetant manuellement 700 microlitres d’un titrage 1:1500 d’une solution de coloration nucléaire sur le tissu. Pour préparer l’instrument d’imagerie multiplexé, diluer le tampon d’imagerie multiplexé 10X à 1X avec de l’eau ultrapure traitée DEPC et remplir les flacons de réactifs avec des solutions ou des solvants appropriés.
Définissez tous les paramètres du microscope et sélectionnez les régions d’intérêt sur le couvercle de l’échantillon à imager. Entrez la conception expérimentale dans le logiciel de gestion d’instruments. Cliquez sur le bouton Expérimenter dans le logiciel de contrôle, puis dans la fenêtre Configuration et gestion des expériences, cliquez sur le bouton Nouveau modèle.
Tapez le nom du projet dans l’espace situé à côté du bouton Projet, puis entrez le nombre total de cycles. Cliquez sur le bouton Channel Assignment, tapez les informations pour chaque cycle dans les colonnes, telles que le cycle correct, les numéros de puits, les emplacements Z-stack, le nom du marqueur, la classe et le temps d’exposition pour chaque cycle. Démarrez ensuite l’expérience en cliquant sur Démarrer l’expérience et enregistrez-la.
Cliquez sur l’icône QuPath sur l’ordinateur et ouvrez le logiciel. Faites glisser le fichier qptiff vers la fenêtre de la visionneuse. Cliquez sur le bouton Luminosité et contraste pour ouvrir la fenêtre Contraste de luminosité.
Cochez ou décochez le marqueur dans la colonne sélectionnée pour afficher ou masquer le signal du marqueur. Cliquez sur le bouton Zoom pour ajuster pour effectuer un zoom avant ou arrière sur la zone d’intérêt. Lorsqu’elles étaient visualisées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images, les images composites montraient tous les marqueurs ou les marqueurs sélectionnés comme souhaité.
L’intensité du signal, la plage dynamique et la distribution spatiale de tous les marqueurs ont été révélées. Cette technique a permis l’analyse des 26 marqueurs au niveau subcellulaire dans une seule coupe de tissu. En suivant le processus d’analyse d’images multiplex, des approches informatiques peuvent traiter et analyser les données de cellules uniques de haute dimension pour en déduire des informations biologiques et cliniques.
L’analyse d’images par code-barres multiplexage est une méthodologie puissante qui permet aux scientifiques de profiler le tissu tumoral et de répondre à leur question de recherche en fonction des marqueurs dans les panneaux.
