L’importance du protocole réside dans sa commodité dans le peu de temps nécessaire pour son achèvement. Cela permet un débit élevé, une concentration élevée et un degré élevé d’isolement des trichomes pédonculés et sessiles. Le principal avantage de cette technique est sa simplicité.
Au cours de cette technique, il convient de considérer la densité des trichomes de la source végétale et d’inspecter le degré d’isolement à chaque étape au microscope tout en effectuant le protocole pour la première fois. Nurit Shalev, une experte en cannabis du Volcani Center, fera la démonstration de cette technique. Commencez par écraser un bloc de glace carbonique en petits flocons fins à l’aide d’un marteau et d’un objet dur et plat dans un récipient en plastique de cinq litres.
Utilisez une grande passoire et tamisez les fines flocons de glace sèche de la glace sèche non broyée dans un autre récipient en plastique de cinq litres. Versez environ 200 centimètres cubes de flocons de glace sèche dans un bécher en verre vertical d’un litre. Ajoutez jusqu’à 10 grammes d’inflorescences de cannabis sativa congelées sur la première couche de glace sèche pilée et recouvrez-la d’une couche supplémentaire de 200 centimètres cubes de glace sèche finement broyée.
Ensuite, couvrez l’ouverture du bécher en verre d’un litre avec deux à trois couches d’une moustiquaire de porte moustiquaire d’un millimètre et fixez-la avec des élastiques. Ensuite, versez de l’azote liquide dans un grand récipient en acier inoxydable à fond rond. Insérez un treillis de 350 micromètres dans un tamis à farine ou une passoire à tamis pour couvrir le treillis du tamis de farine par le bas.
Placez ce tamis à farine au-dessus du grand récipient en acier inoxydable à fond rond rempli d’azote liquide. Pour minimiser la perte de la masse tamisée, assurez-vous que la largeur du récipient dépasse celle du tamis à farine. Séparez les trichomes de la matière végétale en secouant le verre d’un litre avec son ouverture pointant vers le bas vers le tamis à farine.
Réserver le bécher toutes les deux à trois minutes, en permettant le tamisage de la glace sèche broyée et du matériel végétal accumulé sur le tamis à farine. Tamiser le tamis à farine horizontalement pour faciliter le passage de la matière végétale dans l’azote liquide dans le récipient en acier inoxydable à fond rond placé en dessous. Ensuite, ajoutez de l’azote liquide au récipient en acier inoxydable et de la glace sèche pilée au bécher en verre d’un litre lorsque leurs niveaux sont faibles.
Lorsque le matériel végétal sur le tamis de farine est épuisé, remplissez le matériel végétal usagé dans le bécher en verre avec 10 grammes supplémentaires de matériel végétal frais et répétez le processus de tamisage jusqu’à la collecte d’une quantité suffisante de trichomes enrichis dans le récipient. Vérifier la présence d’une substance blanche semblable à une poudre au fond du récipient en acier inoxydable immergé dans l’azote liquide avant une observation au microscope pour confirmer la collecte d’un nombre suffisant de trichomes. Ajouter une petite quantité d’azote liquide dans un petit récipient en acier inoxydable propre à fond rond.
Ensuite, pliez un microtamis de 40 par 40 centimètres ayant une maille de 150 micromètres deux fois pour obtenir un pli de 20 par 20 centimètres et ouvrez-le en forme de cône. Fixez le cône en maille au bord du récipient en acier inoxydable à fond rond avec une ou deux épingles à linge de sorte que la partie ouverte du cône soit verticale et que sa partie pointue soit partiellement immergée dans de l’azote liquide. Une fois cela fait, versez doucement l’azote liquide contenant la substance poudreuse blanche obtenue plus tôt dans le cône microtamis.
À l’aide d’une brosse large, rassembler et transférer tout matériel végétal restant du premier récipient dans le cône à mailles de 150 micromètres. Ensuite, détachez soigneusement la pince à linge du couvercle du récipient et ouvrez le cône de microtamis pour localiser les trichomes au milieu du microtamis ouvert. Tenez les quatre coins du microtamis ensemble et immergez la partie centrale contenant les trichomes dans de l’azote liquide.
Trempez doucement et agitez le microtamis dans l’azote liquide pendant une minute. À l’aide d’une aiguille stérile, faites de minuscules trous dans le bouchon d’un tube à essai de 50 millilitres pour éviter la montée en pression. Ramassez les débris végétaux non tamisés, la glace sèche et les trichomes plus gros enveloppés au centre du microtamis dans un tube à essai de 50 millilitres et stockez-les à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.
Transférer séquentiellement les trichomes tamisés immergés dans l’azote liquide à travers des microtamis, en diminuant la taille des coulées de 105 à 80 à 65, puis à 50 micromètres. Après chaque transfert, collectez séparément les trichomes de différentes tailles restant sur le tamis et étiquetez-les. Faites de minuscules trous dans le bouchon du tube à l’aide d’une aiguille stérile.
Transférer les trichomes désirés immergés dans de l’azote liquide et enveloppés dans le tamis de 50 micromètres dans une assiette propre à l’aide d’une cuillère pré-réfrigérée. Ensuite, transférez rapidement les trichomes en poudre dans un tube pré-refroidi de 1,5 millilitre étiqueté à l’aide d’une spatule pré-refroidie, et stockez immédiatement les tubes à moins 80 degrés Celsius pour d’autres études. Au stade initial du processus d’isolement, les morceaux de tissu foliaire étaient prédominants dans la partie isolée, contrairement au produit d’isolement final, qui était entièrement composé de trichomes isolés non contaminés.
La qualité de la tige granulaire isolée et des trichomes sessiles a été observée lors de la dernière étape d’isolement. La pureté des trichomes isolés à l’aide de cette méthode était comparable à un protocole conventionnel. La structure délicate de la tête du trichome pédonculé a été conservée et toutes les têtes du trichome à tige isolée étaient visibles, contrairement à la méthode traditionnelle, où la structure complète de la tête du trichome était manquante et où seules des cellules discales étaient présentes.
L’extraction de l’ARN et l’estimation de l’intégrité de l’ARN des trichomes isolés ont indiqué un nombre élevé d’intégrité de l’ARN ou des valeurs RIN de 9,4 à 10, et la chromatographie sur gel a indiqué une intégrité élevée de l’ARN. Effectuez soigneusement le mouvement de perfusion en forme de sac T de l’isolement microtamisé de 150 à 50 micro-tamis. Cette méthode peut fournir des informations sur la composition transcriptomique et probablement protéomique des trichomes du cannabis et des trichomes d’autres espèces végétales.
Suite à cette procédure, des caractérisations métaboliques et transcriptomiques peuvent être effectuées. Ces méthodes supplémentaires peuvent aider à comprendre les niveaux d’expression des gènes dans les trichomes isolés et leurs profils métaboliques. Cette technique a permis la caractérisation transcriptomique de trichomes glandulaires de différentes variétés de cannabis.
